야생 유충에서 Hemocytes을 추출하기위한 간단한 프로토콜

요약

곤충 hemocytes는 곤충 개발의 모든 단계에 걸쳐 면역 및 비 면역 모두 여러 중요한 기능을, 실시합니다. hemocyte 유형 및 기능의 현재 우리의 지식은 곤충 유전자 모델에 대한 연구에서 비롯됩니다. 여기, 우리는 추출 정량화과 야생 유충에서 hemocytes을 시각화하는 방법을 제시한다.

초록

곤충 hemocytes은 (포유류의 백혈구에 해당) 곤충의 수명주기에 걸쳐 ^한 여러 생리적 과정에 중요한 역할을한다. Lepidoptera (나방과 나비)와 Diptera (진정한 파리)의 주문에 속하는 곤충의 애벌레의 단계에서 hemocytes은 림프의 선 (전문 조혈 장기) 또는 배아 세포로부터 형성되어 성인 무대에를 통해 수행 할 수 있습니다. 배아 hemocytes는 염증이 기간 동안 개발과 chemotaxis 규정 동안 세포 이주에 참여하고 있습니다. 또한 세포 apoptosis에 참여하고 embryogenesis ² 필수적입니다. Hemocytes는 세포 확산, 세포 집합, nodules의 형성, phagocytosis 및 외국 침략자 ^3의 캡슐화와 같은 여러 기능을 포함하는 곤충 본래 면역 반응의 세포 팔을 중재. 그들은 같은 PR로도 감염시 특정 곤충 체액 방어에서 일을 꾸미고 책임이 있습니다항균 펩티드 및 기타 이펙터 분자 ^{4, 5} oduction. Hemocyte 형태 및 기능은 주로 과일 파리, Drosophila melanogaster ^{6, 7,} 모기 Aedes aegypti 및 아노펠레스 gambiae ^{8, 9,} 담배 hornworm, Manduca sexta ^{10, 11을} 포함, 유전자 또는 생리 곤충 모델에서 공부하고 있습니다. 그러나, 작은 정보는 현재 다양성, 분류, 형태, 특히 비 모델 곤충 종, 야생 ^{12 일부터} 수집 된 사람들의 hemocytes의 기능에 대해 존재합니다.

여기 야생 유충에서 hemocytes를 추출하기위한 간단하고 효율적인 프로토콜을 설명합니다. 우리는 어미에서 두 번째의 음절 instar Lithacodes fasciola (노란색 어깨 슬러그 나방) (그림 1)과 Euclea delphinii (가시 오크 총알) 유충을 (Lepidoptera : Limacodidae)를 사용하여 보여주고 hemolymph의 충분한 볼륨 (곤충 혈액)격리 및 hemocyte 번호는 개인 애벌레에서 계산 할 수 있습니다. 이 방법은 효율적으로 이러한 종뿐만 아니라 현장에서 수확 기타 관련 lepidopteran의 유충에 hemocyte 유형을 공부하는 데 사용할 수 있습니다, 또는 그것은 쉽게 미생물 또는 기생 생물 ¹³ 감염에 따라 hemocyte 기능을 조사하기위한 면역 assays과 함께 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 재료 준비

1. 붕규산 유리 모세관 튜브 및 micropipette의 풀러를 사용하여 바늘 (1-2 μm 팁과 3~4mm 테이퍼)를 준비합니다. 악기 설정 : 램프 : 561, 속도 : 20, 열 : 560, 지연 : 1, 풀다운 : 100, 압력 : 500.
2. 태아 소 혈청 (FBS)의 10 % 항응고제 버퍼의 20 % (98 MM NaOH, 186 MM NaCI, 1.7 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 41 MM 구연산, pH를 4.5로 보충 그레이스의 중간 (GM)의 60 %를 수집 솔루션을 준비 ). 위의 솔루션은 무균 조건 하에서 신선 준비 항상 얼음에 보관됩니다.
3. GM의 90 %가 FBS의 10 %를 보충 : 부화 버퍼 솔루션을 준비합니다. 이 솔루션은 또한 신선한 준비 항상 얼음에 보관됩니다.
4. 적어도 15 μl의 총 × 수집 및 부화 솔루션 모두에 대한 곤충의 수를 준비합니다.

2. 수집 솔루션과 유충의 주입

1. 어미에서 두 번째의 음절 기능을 마취hemocyte 추출하기 전에 20 분을 위해 얼음을 냉각하여 타르 애벌레.
2. 20 ML 유리 주사기 (그림 2)에 연결되....

결과

여기에 설명 된 프로토콜은 각각의 유충에서 곤충 hemolymph의 10-20 μl의 최소 볼륨의 수집 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 수집 Hemocytes은 셀 거리며 걷게, melanization 결함, 조직 파편이나 기타 오염 물질 무료입니다. 따라서 hemocytes은 쉽게 관찰하고 현미경으로 계산하고, 여러 곤충은 몇 hosur에서 관찰 할 수있다 할 수 있습니다. 우리는 우리의 샘플에서 hemocytes의 대부분이 plasmatocytes ³ ​​(hemocytes이 비대칭 확산) (그림 4)로 구성되어 있다고 관찰했다. 현재 세부 (Stoepler 외., 게시되지 않은 데이터)에서 이러한 유충에있는 다른 hemocyte 유형을 특성화하고 있습니다. 여기에 설명 된 방법은 현장 실험에서 수집 한 개인 유충에 대한 총 hemocyte 숫자를 계산을위한 신속하고 정확한 방법을 제공합니다.

hemo.......

토론

의학적으로 중요한 곤충 lepidopteran 모델 곤충에서 hemocytes를 추출하기위한 방법은 이전 ^{9, 14보고되었습니다.} Hemocyte 추출 방법은 곤충 종에 따라 조정되며, 곤충 및 형태학의 기능의 발달 단계. 예를 들어, Manduca의 애벌레에서 hemolymph 절연은 쉽게 복부 ^15의 끝 부분 곡선 경적을 snipping 의해 수행 할 수 있습니다. 슬러그 유충 (Limacodidae)이 복부 구조를 부족하기 때문에, 우리는 소규모 현장 수집 유충에서 hemolymph 추출을위한 별개의 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법은 더 실험에 저장하거나 처리 할 수​​ hemocyte 세포의 큰 숫자를 포함하는 충분한 hemolymph 볼륨을 분리에 대한 효율적인 증명한다. 또한, 성인 모기의 hemocyte 컬렉션은주의 다리의 제거, 날개와 복부 ¹⁶ 팁을 포함 시간이 많이 소요 단계를 포함 . 비슷한 단계의 프로토콜에 필요하.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
Micropipette 풀러	셔터 악기	P-1000
붕규산 유리 관	셔터 악기	B100-50-10	OD : 1.0, ID : 0.50 mm
그레이스의 중간	시그마	G8142
태아 소 혈청	온도 피셔 과학	SH3007102	inactivated 열
뒤몽 # 5 포셉	정밀 과학 도구	11252-40
Neubauer hemocytometer	Hausser 과학	3200
플라스틱 tubiNG	트라이 테크	TT-3-32OD	OD : 3 / 32 인치, ID : 1 / 32 '
유리 의료 주사기	포르투나 Optima	D-97877	50 ML 볼륨
무딘 끝 바늘	소형 부품	NE-162PL-25	16 게이지 X 1 "길이