一个简单的协议提取血细胞从野生毛毛虫
Summary
昆虫的血细胞进行了许多重要的功能，包括免疫和非免疫，昆虫生长发育的各个阶段的。我们目前的知识来自血细胞类型和功能对抗虫基因模型的研究。在这里，我们提出了野生毛毛虫血细胞提取，量化和可视化的方法。
Abstract
昆虫血细胞（相当于哺乳动物白血细胞）的昆虫的整个生命周期的1几种生理过程中发挥重要的作用。在幼虫阶段的昆虫，属于鳞翅目（飞蛾和蝴蝶），双翅目（真苍蝇）的订单，血细胞形成的淋巴腺（一个专门的造血器官）或胚胎干细胞，可以通过到成年阶段。参与胚胎血细胞在细胞迁移过程中的发展和趋化调控在炎症过程中。他们还参与细胞凋亡和胚胎发育2是必不可少的。血细胞介导的细胞手臂的昆虫先天免疫反应，包括多种功能，如细 胞扩散，细胞聚集，形成结节，细胞吞噬功能和外国侵略者的封装3。他们还负责编排特定的昆虫体液防御感染过程中，如公关最大制本抗菌肽和其他效应分子4，5。栉孔扇贝血细胞的形态和功能主要是研究遗传或生理昆虫模型，包括果蝇， 果蝇 6，7，蚊子埃及伊蚊和冈比亚按蚊 8日，9日和烟草天蛾，烟草天蛾 10，11。然而，目前的资料很少存在的多样性，分类，形态和功能的血细胞非模式昆虫物种，特别是那些从野生12。
在这里，我们描述了一个简单而有效的协议，提取野生毛毛虫血细胞。我们使用：，倒数第二龄Lithacodes片形吸虫 （黄肩蛞蝓蛾）（ 图1）和Euclea delphinii（多刺的橡木蛞蝓）毛毛虫（鳞翅目：刺蛾科），并表明，足量的血淋巴（昆虫血）可以分离和血细胞的数目计数从个别幼虫。此方法可用于有效地研究在这些物种以及从外地收获在其他相关的鳞翅目毛虫的血细胞类型，或它可以容易地结合旨在探讨血细胞的功能与微生物或寄生生物13感染后的免疫学测定方法。
Protocol
1。材料制备准备用硼硅玻璃毛细管和微管拉拔器的针头（1-2微米的头和锥度3-4毫米）。仪器设置：斜坡：561速度：20;热：560;延迟：1;拉：100压力：500。 准备在收集解决方案：Grace的中等（GM）辅以10％的胎牛血清（FBS）和抗凝血剂缓冲区的20％（98毫米的NaOH，186 mM的氯化钠，1.7 mM的EDTA和41 mM的柠檬酸酸，pH值4.5的60％ ）。在无菌条件下，将上述溶液制备新鲜，并在任何时候都在冰上?…
Representative Results
本文描述的协议允许的最小体积的10-20微升从个别毛虫昆虫血淋巴的集合。血细胞收集使用此方法是无细胞结块，黑化缺陷，组织碎片或其他污染物。因此血细胞可以很容易地观察和显微镜下计数，和几种昆虫可以观察到，在短短的Hosur。我们观察到，在我们的样本中的血细胞的大部分包括浆细胞3（血球扩频不对称）（ 图4）。目前，我们正在表征不同的血细胞类型中发现这?…
Discussion
从医学上重要的昆虫，鳞翅目模式昆虫血细胞中提取先前已报道的方法9，14。血细胞提取方法适于根据昆虫种类，发育阶段的昆虫和其形态特征。例如，可以容易地进行从烟草天蛾幼虫的血淋巴中分离，通过剪断腹部15的端部的弯曲角附近。因为刺蛾幼虫（刺蛾科）缺乏这方面腹部的结构，我们已经开发了一种独特的协议为小型现场采集的毛毛虫血淋巴中提取。此方法?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TMS支持的哈伦信托奖学金（GWU）在研究过程中。经费实地收集和育种研究片形吸虫和 E。 delphinii提供了由国家科学基金会资助DEB 0642438 JTL。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Borosilicate glass tubes | Sutter Instruments | B100-50-10 | OD: 1.0, ID: 0.50 mm |
| Grace’s Medium | Sigma | G8142 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH3007102 | Heat inactivated |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11252-40 | |
| Neubauer hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| Plastic tubing | Tri-Tech | TT-3-32OD | OD: 3/32”, ID: 1/32′ |
| Glass medical syringe | Fortuna Optima | D-97877 | 50 ml volume |
| Blunt end needle | Small Parts | NE-162PL-25 | 16 Gauge x 1″ length |
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HemocytesWild CaterpillarsInsect Immune ResponseLymph GlandEmbryonic HemocytesLarval StagesInsect Innate Immune ResponseCell MigrationChemotaxis RegulationCell ApoptosisEmbryogenesisCell SpreadingCell AggregationNodules FormationPhagocytosisEncapsulationAntimicrobial PeptidesEffector MoleculesHemocyte MorphologyHemocyte FunctionNon-model Insect Species
Cite This Article
Stoepler, T. M., Castillo, J. C., Lill, J. T., Eleftherianos, I. A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars. J. Vis. Exp. (69), e4173, doi:10.3791/4173 (2012).