Summary
פרוטוקול זה מתאר את השימוש זרימת משיק חלול סיבים מערכת ultrafiltration מדגם ריכוז דיסוציאציה חום כמו צעדים חלופיים עבור זיהוי של waterborne
Abstract
מינים Cryptosporidium ו Giardia הם שניים הנפוצה ביותר פרוטוזואה כי waterborne לגרום להתפרצות מחלת שלשולים ברחבי העולם. כדי לאפיין טוב יותר את השכיחות של גורמי מחלה אלה, שיטת EPA 1623 פותחה להשתמש כדי לפקח על רמות של האורגניזמים במי שתייה בארה"ב מספקת 12. השיטה כוללת שלושה חלקים עיקריים: הראשון הוא ריכוז מדגם שבו לפחות 10 ליטר של מים עיליים גלם מסוננת. אורגניזמים ופסולת הם לכודים eluted אז מן לסנן centrifuged להמשיך לרכז את המדגם. החלק השני של השיטה משתמשת הליך ההפרדה immunomagnetic שבו דגימת מים מרוכזת מוחל על חרוזים immunomagnetic באופן ספציפי להיקשר אאוציסטות Cryptosporidium וציסטות Giardia המאפשר הסרת מסוים של טפילים מן ההריסות מרוכז. (OO) ציסטות אלה מנותקים מכן על ידי ניתוק חומצה proce מן חרוזים מגנטייםדורה. החלק האחרון של השיטה הוא מכתים ספירה immunofluorescence והיכן (OO) ציסטות מוחלים על מוכתם שקופית, מנה על ידי מיקרוסקופ.
שיטה 1623 יש ארבע הרשומים ריכוז מדגם מערכות ללכוד שביצים Cryptosporidium וציסטות Giardia במים: מסננים Envirochek (מל Corporation, אן ארבור, מישיגן), Envirochek מסננים HV (מל Corporation), Filta-Max מסננים (IDEXX, ווסטברוק, MA) או סיחרור זרימה רציפה (Haemonetics, Braintree, MA). עם זאת, Cryptosporidium ו Giardia (OO) החלמה ציסטה השתנו מאוד בהתאם מטריקס מקור מים ומסננים להשתמש 1,14. הזרימה החדשה משיק חלול סיבים ultrafiltration (HFUF) מערכת לאחרונה הוכח להיות יעיל יותר וחזק יותר מחלים שביצים Cryptosporidium וציסטות Giardia של מטריצות מים שונים, ומעבר לכך, זה זול יותר מאשר האפשרות כמוסה אחרת המסנןזה יכול להתרכז פתוגנים רבים בו זמנית 1-3,5-8,10,11. בנוסף, מחקרים קודמים על ידי היל ועמיתיו הראו כי HFUF שיפור משמעותי Cryptosporidium החלמה שביצים בהשוואה ישירות עם מסנני HV Envirochek 4. שינויים נוספים על השיטות הקיימות דווחו גם כדי לשפר את ביצועי השיטה. התקנה מחדש של הליך חומצה ניתוק עם חום ניתוק הוצגה להיות יעילים יותר להפריד Cryptosporidium מן חרוזים מגנטיים כמה מטריצות 9,13.
פרוטוקול זה מתאר שיטה שונה 1623 המשתמש במערכת חדשה סינון HFUF לשלב ניתוק חום. השימוש HFUF באמצעות שיטה זו שונה היא אלטרנטיבה זולה יותר ל-EPA הנוכחית 1623 אפשרויות שיטת סינון ומספק גמישות רבה יותר בכך שהוא מאפשר ריכוז של אורגניזמים מרובים.
Protocol
1. תזרים משיק הולו סיבים Ultrafiltration נוהל
- הכנת מאגרים ופתרונות:
Elution פתרון (1 ל '):
עד 1 ליטר מים כיתה מגיב להוסיף 0.1 גרם נתרן polyphosphate, 0.1 מ"ל Tween-80 ו 0.01 מ"ל Y-30 antifoam. - הכן מסנן ההרכבה (איור 1) בארון בטיחות ביולוגית:
- הכנס Masterflex I / P 73 צינורות המעבדה דרך הראש I / P איזי טען משאבת Masterflex מחובר כונן I / P brushless דיוק Masterflex.
- לאבטח את צינורות ל מד 0-60 PSI גליצרין מלא, לחץ מצויד סניף T-NPT מחבר במעלה הזרם של ראש משאבה עם מהדק בורג, וכדי טי מחבר במורד HDPE של ראש המשאבה.
- להרכיב את הבקבוק retentate ידי התאמת Nalgene 53-B מילוי / אוורור כובע עם צינורות Masterflex 15 L / S מעבדה T-מחבר ואבטחת אותו 1 ליטר בקבוק Nalgene חובה כבדה פוליפרופילן.
- התאמה Masterflex L / S 24 צינורות Wמהדק ith קמצוץ (מהדק קמצוץ 2) ולחבר אותו מבקבוק retentate כדי HDPE T-מחבר.
- חבר את L / S Masterflex 24 צינורות במעבדה מ מד לחץ Kasei אסאהי Rexeed 25s גבוהה השטף dialyzer עם מהדק בורג, ומן dialyzer לבקבוק retentate. השתמש מחוייט מתאמי ומחברי DIN שנועדו להכיל ¼ "צינורות מזהה לחבר את צינור חלול כדי ultrafilter סיבים.
- התאמה Masterflex L / S 24 צינורות במעבדה עם מהדק קמצוץ (מהדק קמצוץ 1) ולחבר אותו טפטפת פלסטיק 10 מ"ל עם פקק עצה וכותנה להסיר לפעול כקו ספיגת מדגם ולאחר מכן לצרף את צינורות HDPE טי המחבר.
- התאמה קצה אחד של צינור L/S-36 המעבדה Masterflex עם כבש מלחציים ולחבר את צינור ליציאת השפכים נמצא לקראת סוף היציאה של המסנן. מניחים את הקצה השני של מיכל הפסולת.
- הוסף 0.01% (w / v) polyphosphate נתרן מדגם 10 מים ל ומערבבים במשך 3 דקות.
- סגור מהדק קמצוץ 2והסר את מכסה האוורור מהבקבוק retentate. כל מהדק אחרים צריכים להיות פתוחים.
- לקבוע את כיוון משאבת להעביר את הנוזל מהמחבר-T ל מד לחץ (מימין לדמות הבאה שמאלה 1). להתאים את מהירות המשאבה ל 25% מהירות מקסימלית להפעיל את המשאבה.
- כאשר הבקבוק retentate הוא 2/3 תפס מלא, קורט פתוח 2 במהירות להחליף את כובע פורקן בקבוק retentate. בדוק את כל הקווים ואביזרים כדי להבטיח שאין נזילות.
- לאט לאט להגביר את מהירות המשאבה לשיעור הסינון הרצויה (כ 1.5 ליטר / דקה), בדיקת דליפות. באמצעות גליל סיים את לימודיו מטר טיימר או זרימה, לבדוק את שיעור תסנין מים היציאה מקו בשפכים (כחול L / S 36 צינורות באיור 1). בועות אוויר יכול להיווצר בדרך כלל בסוף היציאה של המסנן ולכן קשה להשיג בלחץ יציבה בשיעור סינון. זו תוקנה על ידי צובט את קו שפכים ביד לרגע. פעולה זובדרך כלל לפתות בועת אוויר לנמל תסנין וכן כדי לצאת דרך קו השפכים. חזור על פי הצורך, תוך התחשבות כי בועות אוויר בגודל אפונה הם לעתים קרובות בלתי נמנעת.
- לפקח על תהליך סינון. מדוד ורשום את הלחץ וקצב סינון לפי הצורך. הלחץ לא יעלה על 20 psi. מומלץ כי קצב הסינון לא יעלה על 2.0 ליטר / דקה. חשוב כי נפח המים בבקבוק retentate להיות במעקב כדי לוודא שהוא לא מרוקן. זה נורמלי נפח כדי להגדיל או להקטין מעט. אם נפח המים בבקבוק retentate יורד מתחת 1/3 מלא, ולאחר מכן להסיר את מכסה האוורור ואת קמצוץ קרוב לצבוט 2 על הקו בקבוק retentate. להביא את עוצמת הקול בחזרה בערך 2/3 מלא, פתח את תפס במהירות להחליף את מכסה האוורור, על מנת להבטיח חותם חזק. אם נפח בקבוק retentate נופל במהירות ברציפות, ולאחר מכן להבטיח את מכסה הבקבוק retentate הוא חזק מכסה האוורור הוא בבטחה במקום, וכי טוביng הוא עדיין בקשר עם המדגם מים. אם נושאים אלה לא מתרחשים, אז סביר להניח כי החותם על מכסה הבקבוק retentate רע וצריך להחליף.
- כאשר מיכל מדגם ריק, מהדק קמצוץ קרוב מיד 1, להפחית את מהירות המשאבה 20% המקסימלית שלה, להסיר את מכסה האוורור מהבקבוק retentate וסגור את תפס הסוללה.
- להתאים את עוצמת הקול של מדגם בבקבוק retentate ל כ 200 מ"ל ידי הידוק או להתרופפות מהדק הרמפה. לאחר בנפח כ 200 מ"ל, להדק את תפס הסוללה על הצעדים elution (1.11-1.12).
- הוסף 500 מ"ל של תמיסת elution למיכל מדגם ולשטוף את פנים המיכל. מניחים את פיפטה 10 מ"ל מחובר לקו ספיגת מדגם לתוך המיכל המכיל את הפתרון elution. ודא מהדק הרמפה סגור. קורט פתח לצבוט 1 ו 2 לצבוט צביטה קרוב לרגע להכין פתרון elution.
- אחרי 500 מ"ל של תמיסת elution נמשך עד, קרוב לצבוט מהדק 1 ו מהדק קמצוץ פתוח 2. אפשר פתרון elution להסתובב במשך 5 דקות במהירות משאבה של 20% לכל היותר שלו.
- להתאים את עוצמת הקול של מדגם בבקבוק retentate כדי מ"ל על 100 על ידי הידוק או להתרופפות מהדק הרמפה על הקו בשפכים. להדק את תפס הסוללה ולאפשר מדגם להפיץ דקה 1. למנוע משיכת אוויר לתוך צינורות ידי הבטחת נפח דגימה בבקבוק retentate גבוה מספיק כדי לכסות את L / S 15 צינורות הכניסה את הבקבוק retentate.
- להפוך את הכיוון של המשאבה, אשר מאלצת את המדגם לתוך הבקבוק retentate. אפשר המשאבה לפעול גם בכיוון ההפוך למשך 20 שניות וכתוצאה מכך סכום כולל של 225 מ"ל בבקבוק ~ retentate. כבה את המשאבה.
- הסר את I / P Masterflex 73 צינורות מהראש משאבת ונתק את מד הלחץ. נתק את L / S Masterflex 24 צינורות היציאה ultrafilter חלול סיבים. להחזיק את הבקבוק מעל צינורות retentate לכפות על כל המדגם הנותרretentate בקבוק.
- לנתק את כל צינורות מבקבוק ולהחליף את הכובע אוורור עם כובע לא אוורור.
- המשך הליך IMS / IFA עם retentate ~ 225 מ"ל.
2. ההפרדה Immunomagnetic נוהל
- הכנת מאגרים ופתרונות:
- אפשר מאגרי הכלולים Dynabeads את: Cryptosporidium / Giardia ערכת משולבת להגיע לטמפרטורת החדר.
- SL-1X חיץ: הוסף 1 מ"ל של 10X SL-חיץ עד 9 מ"ל מים מגיב בכיתה.
- מעבירים את ~ 225 מ"ל של נוזל מבקבוק retentate כדי צינור שכותרתו מ"ל 250 צנטריפוגות חרוטית. יש לשטוף את הבקבוק retentate פעמיים עם 10 מ"ל מים מגיב, ולהוסיף את שטיפות לצינור צנטריפוגות חרוטית. בצנטריפוגה ההשעיה XG ב 1500 במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס עם הבלם לא.
- בזהירות לשאוב supernatant מממשק אוויר מים עד 5 מ"ל מעל גלולה מלא עבור כל 0.5 מ"ל של נפח כדורית (aspirate כלומר עד 15 מ"ל מעל נפח כדורית של 1.3 מ"ל ו 5 מ"ל aspirate אל על גלולה של 0.5 מ"ל או פחות).
- יסודי resuspend גלולה לתוך supernatant ידי vortexing ו / או פיפטה ערבוב. להעביר את כל נפח 5 מ"ל של נוזל כדי צינור שטוח צדדית L10 Dynal המכילה 1 מ"ל כל אחד 10X SL-חוצץ ו 10X SL-חוצץ ב 'יש לשטוף את הצינורית צנטריפוגות חרוטי פעמיים עם 2.5 מ"ל מים מגיב ולהוסיף לשטוף את צינור L10, מביא את סך נפח מ"ל L10 צינור עד 12, כולל מאגרים.
- הוסף 100 μl לכל אחד גם מעורב Dynabeads נגד Cryptosporidium ואנטי Giardia resuspended לצינור L10. סובב את הצינור L10 בסל"ד 18 שעה 1 בטמפרטורת החדר על מערבל מסובבי.
- הנח את הצד השטוח של צינור L10 נגד מגנט MPC-6 ורוק יד בעדינות צינור מקצה לקצה, 180 מעלות במשך 2 דקות.
- שמירה על צינור L10 מגנט MPC-6 עם הצד מגנט למעלה, למזוג supernatant מן חרוז / (oo) מתחמי ציסטה BouND אל מגנט. הסר את הצינור L10 מן מגנט ומוסיפים 0.5 מ"ל של 1X SL-חיץ אל הצינור. מעבירים את ההשעיה באמצעות שתי שטיפות נוספות של 0.5 מ"ל של 1X SL-חיץ לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל שנערך MPC-S עם מגנט במצב אנכי.
- בעדינות לטלטל את הצינורית ° MPC-S מגנט 180 לדקה 1. עם מגנט במקום, לשאוב supernatant באמצעות פיפטה פסטר מכוון אל החלק התחתון של הצינור microcentrifuge.
- הוסף 1 מ"ל של 1X PBS לצד הקדמי של הצינור microcentrifuge, להסיר את המגנט ואת לטלטל את הצינור בעדינות רק עד חרוזים הם resuspended. החלף את המגנט במצב אנכי בעדינות רוק ° 180 צינורית דקה 1. Aspirate PBS לשטוף, מבלי להפריע את הכדור ביד, בעזרת פיפטה פסטר להסיר כמו שברים רבים ככל האפשר.
- הסר את המגנט ולהוסיף 50 μl מים מגיב לצד האחורי של הצינור microcentrifuge. המערבולת צינור במלוא המהירות ל -50 שניות,ואז דגירה צינור ב 80 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ואחריו מערבולת 2 30. החלף את המגנט לתוך MPC-S במצב משופע, מחייב את החרוזים על מגנט ולהשאיר את (OO) ציסטות בנוזל. החל את ההשעיה (OO) ציסטה לשקופית SingleSpot היטב.
- חזור על שלב 2.10, החלת נוזל המכיל גם אותו ניתוק 1. במקום שקופיות על 37 ° C שקופיות חם במשך שעה 1 לייבש את ההשעיה לשקופית היטב.
3. צביעה ובדיקה
- הכנת מאגרים ופתרונות:
עבודה פתרון DAPI: הוסף 25 μl של פתרון המניות DAPI (2 מ"ג / מ"ל מתנול) ל 25 מ"ל של 1X PBS. חנות מניות פתרונות העבודה בין 1 ° C, 10 ° C בחושך. - החל 50 μl של מתנול לשקופית גם ולאפשר לו להתייבש בטמפרטורת החדר.
- הוסף 50 μl של פתרון DAPI עובד לשקופית היטב דגירה במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
- השתמש KimwiPE אל הפתיל DAPI מהבאר. החל 50 μl של EasyStain. דגירה על 35 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
- הפתיל את הכתם היטב עם Kimwipe, ואז לאט לאט להוסיף 300 μl של חיץ EasyStain קר תיקון, לאפשר לה לזרום מעבר לשפה גם כן. דגירה של 2 דקות בטמפרטורת החדר.
- השתמש Kimwipe אל הפתיל חיץ מבאר וליישם 10 μl של בינוני EasyStain גובר.
- בזהירות להחיל תלוש כיסוי, הסרת כל הבועות המתרחשות. לאטום את הפתק עם כיסוי הלק ברור.
- לסרוק את השקופית כולה באמצעות מסנן FITC, בהגדלה של 200X כולל, עבור תפוח ירוק אובייקטים דמוי ביצה או כדורי ניאון הדומות oocyst או ציסטה. לבחון את כל האובייקטים כאלה עם מסנן DAPI בהגדלה סך 1000x ולאחר מכן עם DIC, גם בהגדלה סך 1000x. רשום את גודל באמצעות מיקרומטר עינית כיול מאפיינים מורפולוגיים.
- מסמך תוצאות.
הערה: אינפור נוסףmation על ההליך המקורי ניתן למצוא גרסה דצמבר 2005 של שיטת EPA 1623 12. זרימת משיק חלול סיבים ultrafiltration ההליך המתואר משמש במקום סעיף 12.0 של שיטת EPA 1623. דיסוציאציה חום משנה סעיף 13.3.3 של שיטת EPA 1623. הנוהל מתאר גם PBS נוספת לשטוף בתהליך IMS שיכול להיות מוכנס לתוך הגרסה דצמבר 2005 שיטת 1623 אחרי סעיף 13.3.2.16. רשימה מלאה של מוצרי צריכה, חומרים כימיים וציוד המשמשים שיטת EPA 1623 כולל שינויים אלה מופיע ברשימת הציוד.
4. נציג תוצאות
שביצים Cryptosporidium וציסטות Giardia התאושש באמצעות תהליכי סינון והפרדה immunomagnetic מזוהים על ידי ניתוח מיקרוסקופי. בהגדלה של 200X כולל, כל אורגניזם מפגין דפוס מכתים גודל טיפוסי, וצורתו כפי שמוצג באיור 2 Cryptosporidium הוא דמוי ביצה לאובייקט כדורית 4 עד 6 מיקרומטר בקוטר אשר מציג הקרינה מבריק בצבע ירוק תפוח FITC בהיר עם קצוות מודגשים (איור 3 א ). עם DAPI UV, oocyst יציגו באחת מהקטגוריות הבאות תכונה אופיינית: אור צביעה פנימית כחולה עם שפה ירוקה לא ברורה גרעינים (DAPI שלילי), אינטנסיבי צביעה פנימית כחולה, או עד 4 ברורה, תכלת גרעינים (DAPI חיובי - איור 3 ב). תכונות טיפוסיות כוללות חריגות במבנה צבע, או DAPI הקרינה (למשל, גרעינים צבעונית מדי, אדום קורנים מבנים פנימיים). אם האובייקט ניאון פגש הקריטריונים FITC טיפוסי מכתים DAPI, הוא בדק באמצעות התערבות קון ההפרשtrast (DIC). האובייקט נבחן על טיפוסיות מאפיינים מורפולוגיים חיצוניים או פנימיים כמו עיטור קיר התא, או 1 או 2 גרעינים גדולים למלא את התא. אם מבנים טיפוסיים לא ציין, האובייקט נרשם מספר IFA סך לקטגוריה של מבנה אמורפי ריק או עם אחד עד ארבעה sporozoites הנוכחי (איור 3 ג). באופן דומה, Giardia דמויי אובייקטים נבדקים ביחס מכתים FITC ו DAPI כמו גם מאפיינים DIC, כמו axonemes, גופים חציון, גרעינים ציסטות Giardia עגולות על אובייקטים מבריקים בצבע ירוק תפוח ביצה, 8 -. 18 מיקרומטר ארוכות על ידי 5 - 15 מיקרומטר רחב עם קצוות מודגשים בהיר (איור 3D). עם DAPI UV, ציסטה Giardia יציגו DAPI שלילי מכתים או DAPI חיובי מאפיינים (איור 3E). אובייקט ניאון נבדק על ידי DIC עבור תכונות טיפוסית ולא טיפוסית באותו אופן כפי שתואר על Cryptosporidium.אם תכונות טיפוסיות לא ציין, האובייקט נרשם מספר IFA סך מסווג כמבנה ריק אמורפי המכילים, או עם סוג אחד או יותר של מבנים פנימיים בהווה (איור 3 ו).
כל אורגניזם הוא ציין כי יש תכונות טיפוסיות אין נספר ציסטה (OO). ניתוח מיקרוסקופי של דגימות סביבתיות יכול להיות מאתגר כמו שיש יצורים שעשויים אוטומטי לזרוח או צולבות להגיב FITC-מצומדות נגד Cryptosporidium ו / או נגד Giardia נוגדנים 1. מומלץ אנליסט להכיר חיידקים ימיים ועשרות הסקירה של שקופיות כדי לצבור ניסיון לזהות Cryptosporidium ו Giardia. לפחות 3 (OO) ציסטות על השקופית מכתים חיובית השליטה צריך להיות מאופיין לפני כל פגישה על המיקרוסקופ.
בקרת איכות דגימות ניתן מתובל (OO) ציסטות לקבוע rec אחוזיםאוברי protozoan עבור כל משתמש את החישוב:
(Oo) אחוז ציסטה Recovery = ((לדוגמא QC Count - ספירת ממדגם Unspiked) / ספייק) x 100.
באיור 1. ייצוג גרפי של מערכת זרימת משיק חלול סיבים ultrafiltration. צינורות הוא צבע מקודד לסייע היא הרכבה של המערכת.
איור 2. התמונה נציג הקרינה של Cryptosporidium ו Giardia (OO) ציסטות. שביצים Cryptosporidium וציסטות Giardia הוכתמו FITC נגד Cryptosporidium / Giardia נוגדנים המסומנים. חצים, ציסטות Giardia, ראשי חץ, שביצים Cryptosporidium. סך של ארבעה שביצים Cryptosporidium ושישה ציסטות Giardia נמצאו המטוס של המוקד. דוגמאות observאד בהגדלה 200X.
. איור 3 תמונות מיקרוסקופיות של נציג שביצים Cryptosporidium וציסטות Giaridia המשמשים לאפיון שביצים Cryptosporidium (- ג).. מבריק בצבע ירוק תפוח FITC הקרינה של עצמים כדוריים 4 עד 6 מיקרומטר בקוטר בהיר עם קצוות מודגשים (א ') המכילים עד 4 ברורה גרעינים, DAPI תכלת (ב') אחד עד ארבעה sporozoites (ים) לכל oocyst (ג). Giardia ציסטות (ד - ו). מבריק בצבע ירוק תפוח FITC הקרינה הסיבוב לאובייקטים הביצה 8 - 18 מיקרומטר ארוכות של 5 - 15 מיקרומטר רחב עם קצוות מודגשים בהיר (ד ') המכילים עד 4 גרעינים DAPI תכלת (E) עם מבנה אחד או יותר פנימי כזה ניתן להבחין כמו גרעינים (N), הגוף החציוני (M) ו - או axonemes (א) (F). חצים לבנים, מבריקים תפוחים ירוקים הקרינה צביעה שביצים Cryptosporidium ו Giardia ציסטות * פרנסותבמחזה 'כטוב בעיניכם; ראשי חץ גרעינים לבנים, DAPI חיובית. דוגמאות ציין בהגדלה 1000x.
Discussion
Ultrafiltration משיק חלול סיבים הזרימה היא טכניקה חלופית ויעילה הריכוז הראשוני של שביצים Cryptosporidium וציסטות Giardia מן המים. הולו סיבים ultrafiltration הוא זול יותר מאשר פילטרים רגילים. מאז יש לו את היכולת להתרכז שביצים Cryptosporidium וציסטות Giardia ממגוון רחב של מטריצות מים שונים היא אלטרנטיבה יעילה בטכניקות סינון הנוכחי המשמשים שיטת EPA 1623. כמו ברוב שיטות סינון אחרות, סיבים חלולים ultrafiltration נוטה עכירות עם דגימות העכורים ביותר. לחץ מים גבוה היה תוצאה של עכירות הסינון, ולכן מומלץ לעקוב אחרי לחץ בזמן הריצה הסינון. בנוסף שביצים Cryptosporidium וציסטות Giardia, חלול סיבים ultrafiltration הוכח להיות מסוגל להתרכז חיידקים ווירוסים 1-3,5,8. הולו סיבים ultrafiltration Outlined בשיטה זו ניתן להשתמש כדי להתרכז אורגניזמים מרובים במדגם אחד. ראוי לציין כי קבלת נפח הסופי בין 200 ל 250 מ"ל הוא השלב האחרון בהליך קריטי ריכוז כך צנטריפוגה צעדים נוספים, שעלולים לגרום לאובדן (OO) ציסטה, הם נמנעו (שלב 2.2). עם זאת, ומאפשר נפח בקבוק לרדת נמוך מדי יכול להיות השפעות שליליות על התאוששות מאז לא יהיה מספיק נפח נוזל כדי לכפות על כל אאוציסטות או ציסטות לבקבוק retentate. לכן מומלץ לשמור על נפח סופי בין 200 ל 250 מ"ל.
חום ניתוק מהווה חלופה לשלב ניתוק חומצה בשיטת 1623. בשלב זה חלופה הוכח לשפר את ההתאוששות oocyst Cryptosporidium ולהפחית את שיטת וריאציה כאשר מבודדים מן הנהר או מי מגיב 9. השוואה Side-by-בצד של חומצה ומחממים שיטות ניתוק הוכיחו כי באמצעות חום dissociaטה את האורגניזמים מן חרוזים immunomagnetic המיוצר החלמה ממוצע גבוה יותר עבור שניהם Cryptosporidium ו Giardia. בנוסף, הדיוק של החלמה Cryptosporidium ו Giardia היה טוב יותר בדגימות מעובדים עם חום ניתוק לעומת חומצה ניתוק 9.
שילוב של HFUF כצעד ריכוז מאפשר גמישות רבה יותר על ידי מתן יכולת להתרכז אורגניזמים מרובים. בנוסף היא אלטרנטיבה זולה יותר ל 1623 אפשרויות הנוכחית שיטת סינון.
Disclosures
הסוכנות האמריקנית להגנה על הסביבה באמצעות משרד של מחקר ופיתוח בשיתוף עם משרד מי תהום מרכז תמיכה טכנית של שתיית מים מימנה את המחקר המתואר כאן. כל עבודה נתמכה באתר על ה-EPA בארה"ב, בסינסינטי, אוהיו. למרות המידע המתואר במאמר זה כבר במימון מלא או חלקי על ידי הסוכנות להגנת הסביבה בארצות הברית תחת חוזה (חוזים EP-C-06-031) ל שו הסביבה והתשתיות, Inc, זה לא בהכרח משקפים את הדעות של הסוכנות ואין אישור רשמי ואין להסיק קשר כזה. זה כבר נתון לביקורת הסוכנות ואושרו לפרסום.
Acknowledgments
אנו רוצים להודות אן גרים ומיכאל צימרמן לבדיקה ביקורתית של כתב היד הזה ודאג המילטון לתמיכה הטכנית שלו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Asahi Kasei Rexeed 25 S/R wet hollow-fiber ultrafilters | Dial Medical | REXEED25S/R | |
| I/P 73 (Masterflex R-3603), or equivalent | Cole-Parmer | EW-06408-73 | |
| L/S 24 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent | Cole-Parmer | EW-96410-24 | |
| L/S 15 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent | Cole-Parmer | EW-96410-15 | |
| L/S 36 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent | Cole-Parmer | EW-96410-36 | |
| I/P Precision Brushless Drive | Cole-Parmer | EW-77410-10 | |
| I/P Easy Load Pump Head | Cole-Parmer | EW-77601-10 | |
| Black HDPE Tee, 1/4"x 3/8" x 3/8" | US Plastics | 62064 | |
| Masterflex T-connector L/S 15-25 | Cole-Parmer | EG-30613-12 | |
| Nalgene heavy-duty pp 1 L bottle | Cole-Parmer | EW-06257-10 | |
| 10 ml pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11C | |
| Nalgene filling/venting cap for 1/4" tubing, 53B | Cole-Parmer | EW-06258-10 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | A-680-46-10 | |
| Straight coupling, NPT(F), 1/4" | Cole-Parmer | EW-06469-18 | |
| NPT branch tee, natural pp | Cole-Parmer | A-30610-75 | |
| Pinch clamps, 1/2" | Cole-Parmer | EW-06833-00 | |
| Custom fit DIN adapters | Molded Products Corp | MPC-855NS.250 | |
| Ring stand | Fisher Scientific | 14-670B | |
| Ring stand clamps | Fisher Scientific | 05-769-6Q | |
| Keck ramp clamp, 14mm | Cole-Parmer | EW-06835-10 | |
| Sodium polyphosphate | Sigma-Aldrich | 305553 | |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 72050 | |
| Antifoam Y-30 emulsion | Sigma-Aldrich | A5758 | |
| Tween-80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| 10 L Collapsible high-density polyethylene cubitainer | VWR international | IR314-0025 | |
| Centrifuge bottle rack | Fisher Scientific | 05-663-103 | |
| 250 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430776 | |
| Disposable funnel | Cole-Parmer | U-6122-10 | |
| Wash bottle | Cole-Parmer | U-06252-40 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Allegra X-15R | |
| Swinging bucket rotor | Beckman Coulter Inc. | ARIES SX4750 | |
| Centrifuge bucket adapters for 250 ml conical tubes | Beckman Coulter Inc. | 349849 | |
| 200 μl large bore pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-134 | |
| VacuShield Filter | Gelman | 629-4402 | |
| 5 ml pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| Dynabeads: Cryptosporidium/Giardia combo kit | IDEXX | 73002 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Falcon BD | 352098 | |
| Dynal L10 flat sided tubes | IDEXX | 74003 | |
| Timer | VWR international | 23609-202 | |
| Dynal MPC-6 magnet | IDEXX | 12002D | |
| 1 ml pipettes | VWR international | 53283-700 | |
| 1.5 ml low adhesion microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| 1000 μl pipette & corresponding barrier tips | Gilson, Inc. | P1000/DF1000ST | |
| 100 μl pipette & corresponding barrier tips | Gilson, Inc. | P100/DF100ST | |
| 9 inch Pasteur pipettes | VWR international | 14672-412 | |
| Dynal MPC-S magnet | IDEXX | 12020D | |
| Vortex | VWR international | 14216-188 | |
| Dynabeads rotator mixer | IDEXX | 94701 | |
| Heat block | Fisher Scientific | 11-718-2 | |
| Lab Armor Beads | Lab Armor | 42370-750 | |
| Digital thermometer | Fisher Scientific | 15-077-60 | |
| Phosphate-buffer saline 1X pH 7.4 (1X PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Single Spot slides | IDEXX | 30201 | |
| Cover glass | Corning | 287018 | |
| EasyStain direct kit | BTF | - | |
| 10 μl pipette & corresponding barrier tips | Gilson, Inc. | P10 & DF10ST | |
| 4',6'-Diamidino-2-phenyl indole dihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | S30697 | |
| Methanol | Fisher Scientific | L6815 | |
| Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 | |
| Incubator | Boekel Scientific | 133000 | |
| slide warmer | Fisher Scientific | 11-474-521 | |
| Immersion oil, Type A ND= 1.515 | Nikon Instruments | MXA20234 | |
| Nikon 90i microscope with DIC capabilities | Nikon Instruments | MBA 77000 | |
| Plan APO 100X oil objective | Nikon Instruments | MRD01901 | |
| Plan Achro 20X | Nikon Instruments | MRL00202 | |
| FITC filter | Nikon Instruments | 96302 | |
| DAPI filter | Nikon Instruments | 96301 | |
| X-cite fluorescence illuminator | Nikon Instruments | 87540 | |
| Lens paper | Nikon Instruments | 76997 | |
| Biohazard disposable bag | Fisher Scientific | 01-829D | |
| Biohazard sharps container | Fisher Scientific | 14-827-117 | |
| 3 % hydrogen peroxide | VWR international | BDH3540-2 | |
| Bleach | Fisher Scientific | 1952030 | |
| Wypall | Kimberly Clark | 34790 |
References
- DiGiorgio, C. L., Gonzalez, D. A., Huitt, C. C. Cryptosporidium and Giardia recoveries in natural waters by using Environmental Protection Agency Method 1623. Appl. Environ. Microbiol. 68, 5952 (2002).
- Hill, V. R., Kahler, A. M., Jothikumar, N., Johnson, T. B., Hahn, D., Cromeans, T. L. Multistate evaluation of an ultrafiltration-based procedure for simultaneous recovery of enteric microbes in 100-liter tap water samples. Appl. Environ. Microbiol. 73, 4218-4225 (2007).
- Hill, V. R., Polaczyk, A. L., Hahn, D., Narayanan, J., Cromeans, T. L., Roberts, J. M., Amburgey, J. E. Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants. Appl. Environ. Microbiol. 71, 6878-6884 (2005).
- Hill, V. R., Polaczyk, A. L., Kahler, A. M., Cromeans, T. L., Hahn, D., Amburgey, J. E. Comparison of hollow-fiber ultrafiltration to the USEPA VIRADEL technique and USEPA method 1623. J. Environ. Qual. 38, 822-825 (2009).
- Holowecky, P. M., James, R. R., Lorch, D. P., Straka, S. E., Lindquist, H. D. Evaluation of ultrafiltration cartridges for a water sampling apparatus. J. Appl. Microbiol. 106, 738-7347 (2009).
- Lindquist, H. D., Harris, S., Lucas, S., Hartzel, M., Riner, D., Rochele, P., Deleon, R. Using ultrafiltration to concentrate and detect Bacillus anthracis, Bacillus atrophaeus subspecies globigii, and Cryptosporidium parvum in 100-liter water samples. J. Microbiol. Methods. 70, 484-492 (2007).
- Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water. J. Microbiol. Methods. 68, 260-266 (2007).
- Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from. 176, 38-45 (2011).
- Shaw, N. J., Villegas, L. F., Eldred, B. J., Gaynor, D. H., Warden, P. S., Pepich, B. V. Modification to EPA Method 1623 to address a unique seasonal matrix effect encountered in some U.S. source waters. J. Microbiol. Methods. 75, 445-448 (2008).
- Simmons, O. D. 3rd, Sobsey, M. D., Heaney, C. D., Schaefer, F. W. 3rd, Francy, D. S. Concentration and detection of Cryptosporidium oocysts in surface water samples by method 1622 using ultrafiltration and capsule filtration. Appl. Environ. Microbiol. 67, 1123-1127 (2001).
- Sobsey, M. D., Glass, J. S. Influence of water quality on enteric virus concentration by microporous filter methods. Appl. Environ. Microbiol. 47, 956-9560 (1984).
- USEPA. Method 1623: Cryptosporidium and Giardia in Water by Filtration/IMS/FA. Office of Water. 815-R-05-002, EPA. (2005).
- Ware, M. W., Wymer, L., Lindquist, H. D., Schaefer, F. W. 3rd Evaluation of an alternative IMS dissociation procedure for use with Method 1622: detection of Cryptosporidium in water. J. Microbiol. Methods. 55, 575-583 (2003).
- Zuckerman, U., Tzipori, S. Portable continuous flow centrifugation and method 1623 for monitoring of waterborne protozoa from large volumes of various water matrices. J. Appl. Microbiol. 100, 1220-1227 (2006).
