Detta protokoll beskriver användningen av ett tangentiellt flöde med ihåliga fibrer ultrafiltrering provkoncentration systemet och en värme dissociation som alternativa steg för påvisande av vattenburna<em> Cryptosporidium</em> Och<em> Giardia</em> Arter när EPA Metod 1623.
Cryptosporidium och Giardia arter är två av de vanligaste protozoer som orsakar vattenburna diarrésjukdomar sjukdomsutbrott över hela världen. För att bättre karaktärisera förekomsten av dessa patogener, var EPA Method 1623 utvecklas och användas för att övervaka nivåerna av dessa organismer i USA dricksvattenförsörjning 12. Metoden har tre huvudsakliga delar: den första är den provkoncentration vid vilken minst 10 liter rå yta vattnet filtreras. Organismerna och infångas debris elueras därefter från filtret och centrifugerades för att ytterligare koncentrera provet. Den andra delen av den metod använder en immunomagnetisk separation förfarande där den koncentrerade vatten provet appliceras till immunomagnetiska pärlor som specifikt binder till Cryptosporidium-oocystor och cystor Giardia möjliggör för specifikt avlägsnande av parasiter från den koncentrerade skräp. Dessa (OO) cystor därefter lösgörs från de magnetiska pärlorna genom en syradissociering förfaranderandet. Den sista delen av metoden är den immunofluorescensfärgning och räkning var (oo) cystor tillämpas på en bild, betsad och räknas i mikroskop.
Metod 1623 har fyra noterade system provkoncentrationen att fånga Cryptosporidium oocystor och cystor Giardia i vatten: Envirochek filter (Pall Corporation, Ann Arbor, MI), Envirochek HV filter (Pall Corporation), Filta-Max filter (IDEXX, Westbrook, MA), eller kontinuerligt flöde Centrifugering (Haemonetics, Braintree, MA). Har dock Cryptosporidium och Giardia (oo) återvinningar cysta varierade kraftigt beroende på källan vattnet matrisen och filter används 1,14. En ny tangentiell strömning ihåliga fibrer ultrafiltrering (HFUF) system har nyligen visat sig vara effektivare och mer robust att återvinna Cryptosporidium oocystor och Giardia cystor från olika vatten matriser, dessutom är det billigare än andra kapseln filteralternativetS och kan koncentrera flera patogener samtidigt 1-3,5-8,10,11. Dessutom tidigare studier av Hill och kollegor har visat att HFUF signifikant förbättrad Cryptosporidium oocyster återvinningar när direkt jämföras med de Envirochek HV filter 4. Ytterligare ändringar av nuvarande metoder har också rapporterats för att förbättra metoden. Byta syran dissociation förfarandet med värme dissociation visade sig vara mer effektivt att skilja Cryptosporidium från de magnetiska pärlorna i vissa matriser 9,13.
Detta protokoll beskriver en modifierad metod 1623 som använder det nya systemet HFUF filtrering med värme dissociationssteget. Användningen av HFUF med denna modifierade metod är ett billigare alternativ till dagens EPA Metod 1623 filtrering alternativ och ger större flexibilitet genom att tillåta koncentrationen av flera organismer.
Tangentiellt flöde med ihåliga fibrer ultrafiltrering är en alternativ och effektiv teknik för den initiala koncentrationen av Cryptosporidium-oocystor och cystor Giardia från vatten. Ihåliga fibrer ultrafiltrering är billigare än de traditionella filter. Eftersom det har förmågan att koncentrera Cryptosporidium oocystor och cystor Giardia från en mängd olika vatten matriser är ett användbart alternativ till de nuvarande filtrerings teknik som används för EPA Method 1623. Som med de flesta andra filtrering metoder, är ihålig-fiber ultrafiltrering benägen att nedsmutsning med extremt grumliga prover. Högt vattentryck skulle bli följden av filtret påväxt, därför rekommenderas att övervaka trycket under filtreringen körningen. Förutom Cryptosporidium-oocystor och cystor Giardia har ihålig-fiber-ultrafiltrering visats vara i stånd att koncentrera bakterier och virus 1-3,5,8. Ihåliga fibrer ultrafiltrering outlined i denna metod kan användas för att koncentrera flera organismer i ett enda prov. Det är anmärkningsvärt att erhålla en slutlig volym mellan 200 och 250 ml är det kritiska sista steget i koncentrationen förfarandet så att extra centrifugeringssteg, som kan resultera i (oo) cystor förlust undviks (steg 2,2). Emellertid kan låta volymen i flaskan för att släppa för låg några negativa effekter på de återkrav eftersom det inte kommer att räcka vätskevolym för att tvinga alla oocystorna eller cystor i retentat flaskan. Därför rekommenderas att bibehålla en slutlig volym mellan 200 och 250 ml.
Värme dissociation är ett alternativ till den syradissociering steg i metod 1623. Detta alternativ steg har visat sig förbättra Cryptosporidium oocyst återhämtning och minska metoden variation när isolerat från antingen floden eller reagens vatten 9. En sida-vid-sida jämförelse av syra och värme dissociation metoder visat att användning av värme för att dissociate organismerna från immunomagnetiska pärlor produceras högre genomsnittliga återvinningar för både Cryptosporidium och Giardia. Dessutom var den precision av Cryptosporidium och Giardia återvinningar bättre i prover behandlade med värme dissociation jämfört med syradissociering 9.
Införlivandet av HFUF som koncentrationen steg ger större flexibilitet genom att ge möjlighet att koncentrera sig flera organismer. Dessutom är ett billigare alternativ till dagskursmetoden 1623 filtrering alternativ.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Ann Grimm och Michael Zimmerman för kritisk granskning av detta manuskript och Doug Hamilton för hans tekniska support.
Equipment/Reagent | Vendor | Catalog # |
Asahi Kasei Rexeed 25 S/R wet hollow-fiber ultrafilters | Dial Medical | REXEED25S/R |
I/P 73 (Masterflex R-3603), or equivalent | Cole Parmer | EW-06408-73 |
L/S 24 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent | Cole Parmer | EW-96410-24 |
L/S 15 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent | Cole Parmer | EW-96410-15 |
L/S 36 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent | Cole Parmer | EW-96410-36 |
I/P Precision Brushless Drive | Cole Parmer | EW-77410-10 |
I/P Easy Load Pump Head | Cole Parmer | EW-77601-10 |
Black HDPE Tee, 1/4″x 3/8″ x 3/8″ | US Plastics | 62064 |
Masterflex T-connector L/S 15-25 | Cole Parmer | EG-30613-12 |
Nalgene heavy-duty pp 1 L bottle | Cole Parmer | EW-06257-10 |
10 ml pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11C |
Nalgene filling/venting cap for 1/4″ tubing, 53B | Cole Parmer | EW-06258-10 |
Pressure gauge | Cole Parmer | A-680-46-10 |
Straight coupling, NPT(F), 1/4″ | Cole Parmer | EW-06469-18 |
NPT branch tee, natural pp | Cole Parmer | A-30610-75 |
Pinch clamps, 1/2″ | Cole Parmer | EW-06833-00 |
Custom fit DIN adapters | Molded Products Corp | MPC-855NS.250 |
Ring stand | Fisher Scientific | 14-670B |
Ring stand clamps | Fisher Scientific | 05-769-6Q |
Keck ramp clamp, 14mm | Cole Parmer | EW-06835-10 |
Sodium polyphosphate | Sigma Aldrich | 305553 |
Sodium thiosulfate pentahydrate | Sigma Aldrich | 72050 |
Antifoam Y-30 emulsion | Sigma Aldrich | A5758 |
Tween-80 | Sigma Aldrich | P1754 |
10 L Collapsible high-density polyethylene cubitainer | VWR | IR314-0025 |
Centrifuge bottle rack | Fisher Scientific | 05-663-103 |
250 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430776 |
Disposable funnel | Cole Parmer | U-6122-10 |
Wash bottle | Cole Parmer | U-06252-40 |
Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R |
Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ARIES SX4750 |
Centrifuge bucket adapters for 250 ml conical tubes | Beckman Coulter | 349849 |
200 μl large bore pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-134 |
VacuShield Filter | Gelman | 629-4402 |
5 ml pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11D |
Dynabeads: Cryptosporidium/Giardia combo kit | IDEXX | 73002 |
50 ml conical centrifuge tubes | Falcon | 352098 |
Dynal L10 flat sided tubes | IDEXX | 74003 |
Timer | VWR | 23609-202 |
Dynal MPC-6 magnet | IDEXX | 12002D |
1 ml pipettes | VWR | 53283-700 |
1.5 ml low adhesion microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 |
1000 μl pipette & corresponding barrier tips | Gilson | P1000/DF1000ST |
100 μl pipette & corresponding barrier tips | Gilson | P100/DF100ST |
9 inch Pasteur pipettes | VWR | 14672-412 |
Dynal MPC-S magnet | IDEXX | 12020D |
Vortex | VWR | 14216-188 |
Dynabeads rotator mixer | IDEXX | 94701 |
Heat block | Fisher Scientific | 11-718-2 |
Lab Armor Beads | Lab Armor | 42370-750 |
Digital thermometer | Fisher Scientific | 15-077-60 |
Phosphate-buffer saline 1X pH 7.4 (1X PBS) | Sigma | P4417 |
Single Spot slides | IDEXX | 30201 |
Cover glass | Corning | 287018 |
EasyStain direct kit | BTF | – |
10 μl pipette & corresponding barrier tips | Gilson | P10 & DF10ST |
4′,6′-Diamidino-2-phenyl indole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 |
Clear nail polish | Fisher Scientific | S30697 |
Methanol | Fisher Scientific | L6815 |
Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 |
Incubator | Boekel Scientific | 133000 |
slide warmer | Fisher Scientific | 11-474-521 |
Immersion oil, Type A ND= 1.515 | Nikon | MXA20234 |
Nikon 90i microscope with DIC capabilities | Nikon | MBA 77000 |
Plan APO 100X oil objective | Nikon | MRD01901 |
Plan Achro 20X | Nikon | MRL00202 |
FITC filter | Nikon | 96302 |
DAPI filter | Nikon | 96301 |
X-cite fluorescence illuminator | Nikon | 87540 |
Lens paper | Nikon | 76997 |
Biohazard disposable bag | Fisher Scientific | 01-829D |
Biohazard sharps container | Fisher Scientific | 14-827-117 |
3 % hydrogen peroxide | VWR | BDH3540-2 |
Bleach | Fisher Scientific | 1952030 |
Wypall | Kimberly Clark | 34790 |