Brug af BLT Humaniseret Mouse som en stamcelle baseret genterapi tumormodel
Summary
Generering og karakterisering af tumorspecifikke T-celler under anvendelse af humaniserede mus er beskrevet her. Humant thymisk væv og genetisk modificerede humane hæmatopoietiske stamceller transplanteres ind immunkompromitterede mus. Dette resulterer i rekonstituering af et manipuleret humant immunsystem muliggør in vivo undersøgelse af anti-tumor immunrespons.
Abstract
Små dyremodeller, såsom mus er blevet flittigt brugt til at studere sygdom hos mennesker og udvikle nye terapeutiske indgreb. Trods det væld af information opnået fra disse studier, de unikke egenskaber muse immunitet samt artsspecificitet af virale sygdomme, såsom humant immundefektvirus (HIV)-infektion har ført til udviklingen af humaniserede musemodeller. De tidligere modeller involveret anvendelse af C. B 17 scid / scid mus og transplantation af humane føtale thymus betegnet og føtal lever thy / liv (SCID-hu) 1, 2 eller den adoptive overførsel af humane perifere blodleukocytter (SCID-huPBL ) 3. Begge modeller blev hovedsagelig anvendt til undersøgelse af HIV-infektion.
En af de vigtigste begrænsninger af begge disse modeller var manglen på stabile rekonstituering af humane immunceller i periferien for at gøre dem mere fysiologisk relevant model til at studere HIV-sygdom. Til dette formål BLT humanized musemodel er udviklet. BLT står for knoglemarv / lever / thymus. I denne model gamle 6 til 8 uger NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) immunkompromitterede mus modtager thy / liv implantat som i SCID-hu muse-modellen kun at blive efterfulgt af en anden human hæmatopoietisk stamcelletransplantation 4. Fordelen ved dette system er fuldstændig rekonstituering af det humane immunsystem i periferien. Denne model er blevet anvendt til at undersøge HIV-infektion og latens 5-8.
Vi har genereret en modificeret udgave af denne model, som vi bruger genetisk modificerede humane hæmatopoietiske stamceller (hHSC) at konstruere thy / liv implantat efterfulgt af injektion af transducerede autologe hHSC 7, 9. Denne fremgangsmåde resulterer i frembringelsen af genetisk modificerede linier. Mere vigtigt har vi tilpasset dette system til at undersøge potentialet af at generere funktionelle cytotoksiske T-celler (CTL), der udtrykker et melanom specifik T-cellereceptor. Brug af denne model var vi i stand til at vurdere funktionaliteten af vores transgene CTL udnytte levende positronemissionstomografi (PET) scanning for at bestemme tumor regression (9).
Målet med denne protokol er at beskrive processen med at frembringe disse transgene mus og vurdere in vivo-effektivitet ved hjælp af levende PET-billeddannelse. Som en note, da vi bruger humane væv og lentivirusvektorer vores faciliteter i overensstemmelse med CDC NIH retningslinier for biosikkerhedsniveau 2 (BSL2) med særlige forholdsregler (BSL2 +). Hertil kommer, at NSG musene alvorligt immunkompromitterede derfor skal deres boliger og vedligeholdelse opfylder de højeste sundheds-standarder ( http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html ).
Protocol
Representative Results
Discussion
Den modificerede BLT humaniseret musemodel kombineret med in vivo PET-billeddannelse er effektive redskaber til at studere kroniske sygdomme hos mennesker. Dette system tager BLT musemodel og forskud det ud over de begrænsede muligheder for HIV-forskning. Endvidere er det en stor system, hvor man kan undersøge forskellige genterapiprotokoller samt diagnostiske teknikker før de kan nå det kliniske miljø. Sidstnævnte kombineret med de lave omkostninger ved at bruge mus versus primater gør dette en meget ny…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Alvin Welch og Larry Pang for deres tekniske assistance. Dette arbejde blev finansieret delvist af National Institutes of Health (NIH) tildeling P50 CA086306, California Institute til regenerativ medicin (CIRM) tilskud RC1-00149-1 og RS1-00.203-1, CIRM New Faculty Award RN2-00.902-1 , den Caltech-UCLA Joint Center for Translationel Medicin, UCLA Center for AIDS Research (CFAR) NIH / NIAID AI028697, UCLA AIDS Institut, CIRM Værktøj og Teknologi Award RT1-01.126, og UC Multicampus Research Program og initiativer fra California Center for Antiviral Drug Discovery (nummer MRPI-143.226).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| PBS | Invitrogen | 10010049 | |
| RPMI 1640 | A1049101 | ||
| Iscove’s | 12440061 | ||
| Fetal Calf Serum | 16000085 | ||
| Collagenase type IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Hyaluronidase | H3506 | ||
| DNAse I | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Piptazo (Zosyn) | Pfizer | Piperacillin/tazobactam combination | |
| Ficoll (Ficoll-Paque Plus) | Ge Healthcare Life Sciences | 17-1440-02 | |
| MACS Buffer | Miltenyi Biotech | See comments | MACS buffer: PBS supplemented with 0.5% fetal bovine serum and 2 mM citrate dextrose formula-A |
| CD34 Microbead Kit | 130-046-702 | ||
| LS Columns | 130-042-401 | ||
| Retronectin | Takara | T100A | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354263 | |
| Isofluorane | Baxter | http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer Animal Health | https://www.rimadyl.com/default.aspx |
References
- McCune, J. M., Namikawa, R., Kaneshima, H., Shultz, L. D., Lieberman, M., Weissman, I. L. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
- Bristol, G. C., Gao, L. Y., Zack, J. A. Preparation and maintenance of SCID-hu mice for HIV research. Methods. 12 (4), 343-347 (1997).
- Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature. 335 (6187), 256-259 (1988).
- Melkus, M. W., Estes, J. D., Padgett-Thomas, A., Gatlin, J., Denton, P. W., Othieno, F. A., Wege, A. K., Haase, A. T., Garcia, J. V. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).
- Denton, P. W., Estes, J. D., Sun, Z., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Powell, D. A., Payne, D., Haase, A. T., Garcia, J. V. Antiretroviral pre-exposure prophylaxis prevents vaginal transmission of HIV-1 in humanized BLT mice. PLoS Med. 5 (1), e16 (2008).
- Sun, Z., Denton, P. W., Estes, J. D., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Melkus, M. W., Padgett-Thomas, M. W. Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4+ T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1. J. Exp. Med. 204 (4), 705-714 (2007).
- Shimizu, S., Hong, P., Arumugam, B., Pokomo, L., Boyer, J., Koizumi, N., Kittipongdaja, P., Chen, A., Bristol, G., Galic, Z., Zack, J. A., Yang, O., Chen, I. S., Lee, B., An, D. S. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
- V, J. Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice. J. Virol. 86 (1), 630-634 (2012).
- Vatakis, D. N., Koya, R. C., Nixon, C. C., Wei, L., Kim, S. G., Avancena, P., Bristol, G., Baltimore, D., Kohn, D. B., Ribas, A., Radu, C. G., Galic, Z., Zack, J. A. Antitumor activity from antigen-specific CD8 T cells generated in vivo from genetically engineered human hematopoietic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (51), 1408-1416 (2011).
