Bruke BLT humanisert Mouse som en stamcelle basert Gene Therapy Tumor Model
Summary
Generering og karakterisering av tumor spesifikke T-celler ved hjelp av humaniserte mus er beskrevet her. Menneskelig thymic vev og genmodifiserte menneskelige blodkreft stamceller er transplantert inn immunsupprimerte mus. Dette resulterer i rekonstituering av en konstruert menneskets immunsystem muliggjør in vivo undersøkelse av anti-tumor immunrespons.
Abstract
Små dyremodeller som mus har vært mye brukt for å studere sykdom hos mennesker og å utvikle nye terapeutiske intervensjoner. Tross mange opplysninger fått fra disse studiene, ledet de unike egenskapene mus immunitet samt arten spesifisitet av virussykdommer slik som humant immunsviktvirus (HIV)-infeksjon til utvikling av humaniserte musemodeller. De tidligere modellene involverte bruk av C. B 17 SCID / SCID mus og transplantasjon av menneskelige foster thymus og fosterets lever betegnet din / liv (SCID-hu) 1, 2 eller adoptiv overføring av humant perifert blod leukocytter (SCID-huPBL ) 3. Begge modellene er i hovedsak brukt for studiet av HIV-infeksjon.
En av de viktigste begrensninger av begge disse modellene var mangel på stabile rekonstituering av humane immunceller i periferien for å gjøre dem mer fysiologisk relevant modell for å studere HIV sykdom. For dette formål, BLT nynneanized mus modellen ble utviklet. BLT står for benmarg / lever / thymus. I denne modellen, 6 til 8 uke gamle NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) immunsupprimerte mus får din / liv implantat som i SCID-hu mus modell bare for å bli etterfulgt av en andre menneske hematopoetisk stamcelletransplantasjon 4. Fordelen med dette systemet er den fullstendige oppløsning av det menneskelige immunsystem i periferien. Denne modellen er blitt brukt til å studere HIV infeksjon og ventetid 5-8.
Vi har generert en modifisert versjon av denne modellen som vi bruker genmodifiserte menneskelige blodkreft stamceller (hHSC) å konstruere din / liv implantat etterfulgt av injeksjon av transduced autolog 7 hHSC, 9. Dette resulterer i at generasjonen av genmodifiserte linjene. Enda viktigere, tilpasset vi dette systemet å undersøke potensialet til å generere funksjonelle cytotoksiske T-celler (CTL) som uttrykker en melanom spesifikke T celle reseptor. Ved hjelp av denne modellen vi var i stand til å vurdere funksjonaliteten vår transgene CTL utnytte levende positronemisjonstomografi (PET) imaging for å fastslå tumorregresjon (9).
Målet med denne protokollen er å beskrive prosessen med å generere disse transgene mus og vurdere in vivo effekt ved hjelp av levende PET imaging. Som et notat, siden vi bruker menneskelige vev og lentiviral vektorer, våre anlegg i samsvar med CDC NIH retningslinjer for biosikkerhet Nivå 2 (BSL2) med spesielle forholdsregler (BSL2 +). I tillegg er NSG mus alvorlig immunkompromitterte dermed må deres bolig og vedlikehold i samsvar med de høyeste helse-standarder ( http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html ).
Protocol
Representative Results
Discussion
Den modifiserte BLT humanisert mus modell kombinert med in vivo PET imaging er kraftige verktøy for å studere kroniske sykdommer hos mennesker. Dette systemet tar BLT mus modell og drar det utover den begrensede muligheter for HIV-forskning. I tillegg er det et stort system som vi kan undersøke ulike genterapi protokoller så vel som diagnostiske teknikker før de kan nå klinisk sammenheng. Sistnevnte kombinert med lave kostnader ved å bruke mus versus primater gjør dette en svært nyttig modell.
<p c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Alvin Welch og Larry Pang for deres teknisk assistanse. Dette arbeidet ble finansiert delvis av National Institutes of Health (NIH) award P50 CA086306, California Institute for regenerativ medisin (CIRM) tilskudd RC1-00149-1 og RS1-00203-1, CIRM New fakultet Award RN2-00902-1 , Caltech-UCLA Joint Center for translasjonell medisin, UCLA Center for AIDS Research (CFAR) NIH / NIAID AI028697, UCLA AIDS Institute, CIRM Tools and Technology Award RT1-01126, og UC Multicampus Research Program og Tiltak fra California Senter for Antiviral Drug Discovery (antall MRPI-143226).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| PBS | Invitrogen | 10010049 | |
| RPMI 1640 | A1049101 | ||
| Iscove’s | 12440061 | ||
| Fetal Calf Serum | 16000085 | ||
| Collagenase type IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Hyaluronidase | H3506 | ||
| DNAse I | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Piptazo (Zosyn) | Pfizer | Piperacillin/tazobactam combination | |
| Ficoll (Ficoll-Paque Plus) | Ge Healthcare Life Sciences | 17-1440-02 | |
| MACS Buffer | Miltenyi Biotech | See comments | MACS buffer: PBS supplemented with 0.5% fetal bovine serum and 2 mM citrate dextrose formula-A |
| CD34 Microbead Kit | 130-046-702 | ||
| LS Columns | 130-042-401 | ||
| Retronectin | Takara | T100A | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354263 | |
| Isofluorane | Baxter | http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer Animal Health | https://www.rimadyl.com/default.aspx |
References
- McCune, J. M., Namikawa, R., Kaneshima, H., Shultz, L. D., Lieberman, M., Weissman, I. L. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
- Bristol, G. C., Gao, L. Y., Zack, J. A. Preparation and maintenance of SCID-hu mice for HIV research. Methods. 12 (4), 343-347 (1997).
- Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature. 335 (6187), 256-259 (1988).
- Melkus, M. W., Estes, J. D., Padgett-Thomas, A., Gatlin, J., Denton, P. W., Othieno, F. A., Wege, A. K., Haase, A. T., Garcia, J. V. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).
- Denton, P. W., Estes, J. D., Sun, Z., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Powell, D. A., Payne, D., Haase, A. T., Garcia, J. V. Antiretroviral pre-exposure prophylaxis prevents vaginal transmission of HIV-1 in humanized BLT mice. PLoS Med. 5 (1), e16 (2008).
- Sun, Z., Denton, P. W., Estes, J. D., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Melkus, M. W., Padgett-Thomas, M. W. Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4+ T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1. J. Exp. Med. 204 (4), 705-714 (2007).
- Shimizu, S., Hong, P., Arumugam, B., Pokomo, L., Boyer, J., Koizumi, N., Kittipongdaja, P., Chen, A., Bristol, G., Galic, Z., Zack, J. A., Yang, O., Chen, I. S., Lee, B., An, D. S. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
- V, J. Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice. J. Virol. 86 (1), 630-634 (2012).
- Vatakis, D. N., Koya, R. C., Nixon, C. C., Wei, L., Kim, S. G., Avancena, P., Bristol, G., Baltimore, D., Kohn, D. B., Ribas, A., Radu, C. G., Galic, Z., Zack, J. A. Antitumor activity from antigen-specific CD8 T cells generated in vivo from genetically engineered human hematopoietic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (51), 1408-1416 (2011).
