Uso del ratón humanizado BLT como un modelo de células madre del tumor Terapia génica basada en
Summary
La generación y caracterización de células T específicas de tumor en ratones humanizados se describe aquí. Tejido del timo humano y genéticamente modificados células madre hematopoyéticas son trasplantados en ratones inmunodeficientes. Esto da como resultado la reconstitución de una ingeniería del sistema inmune humano permitiendo examen in vivo de anti-tumor de la respuesta inmune.
Abstract
Modelos de animales pequeños tales como ratones se han utilizado ampliamente para estudiar las enfermedades humanas y para desarrollar nuevas intervenciones terapéuticas. A pesar de la riqueza de la información obtenida de estos estudios, las características únicas de la inmunidad ratón, así como la especificidad de especie de las enfermedades virales tales como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) condujo al desarrollo de modelos de ratones humanizados. Los modelos anteriores implicaban el uso de C. B 17 scid / scid ratones y el trasplante de timo fetal humano y el hígado fetal denominadas tu / liv (SCID-hu) 1, 2 o la transferencia adoptiva de leucocitos de sangre periférica humanos (SCID-huPBL ) 3. Ambos modelos se utilizaron principalmente para el estudio de la infección por VIH.
Una de las principales limitaciones de estos dos modelos es la falta de reconstitución estable de las células inmunes humanas en la periferia para que sean un modelo fisiológicamente más relevantes para estudiar la enfermedad del VIH. Con este fin, el zumbido BLTmodelo de ratón anized fue desarrollado. BLT es sinónimo de médula ósea / hígado / timo. En este modelo, de 6 a 8 semanas de edad NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SZJ (NSG) ratones inmunocomprometidos recibir el implante tu / liv como en el modelo de ratón SCID-hu sólo para ser seguido por un segundo humana trasplante de células madre hematopoyéticas 4. La ventaja de este sistema es la reconstitución completa del sistema inmunológico humano en la periferia. Este modelo ha sido utilizado para estudiar la infección por VIH y la latencia de 5-8.
Hemos generado una versión modificada de este modelo en el que usamos modificado genéticamente las células madre hematopoyéticas (HHSC) para construir el implante de tu / liv seguida de la inyección de transducidas autólogas HHSC 7, 9. Este enfoque resulta en la generación de linajes genéticamente modificados. Más importante aún, este sistema adaptado para examinar el potencial de generar células funcionales T citotóxicos (CTL) que expresan un receptor específico de melanoma de células T. Utilizando este modelo hemos sido capaces de evaluar la funcionalidad de nuestro CTL transgénico utilizando emisión en directo positrones (PET) para determinar la regresión del tumor (9).
El objetivo de este protocolo es para describir el proceso de la generación de estos ratones transgénicos y evaluación de la eficacia in vivo usando imágenes de PET en vivo. Como nota, ya que utilizamos los tejidos humanos y vectores lentiviral, nuestras instalaciones se ajustan a las directrices del CDC NIH para el Nivel de Bioseguridad 2 (BSL2) con precauciones especiales (BSL2 +). Además, los ratones sin garantía soberana están severamente inmunocomprometidos por lo tanto, su vivienda y mantenimiento deben cumplir con los más altos estándares de salud ( http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html ).
Protocol
Representative Results
Discussion
El modelo de ratón humanizado modificado BLT junto con in vivo PET son herramientas poderosas para estudiar enfermedades humanas crónicas. Este sistema toma el modelo de ratón BLT y lo hace avanzar más allá de las limitadas posibilidades de investigación del VIH. Además, es un gran sistema en el que puede examinar diversos protocolos de terapia génica, así como técnicas de diagnóstico antes de que puedan alcanzar el entorno clínico. Esto último, junto con el bajo coste de la utilización de ratones…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a Alvin Pang Larry Welch y por su asistencia técnica. Este trabajo fue financiado en parte por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de adjudicación P50 CA086306, el Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM) subvenciones RC1-00149-1 y RS1-00203-1; CIRM Premio Facultad Nueva RN2-00902-1 , el Caltech-UCLA Conjunto Centro de Medicina Traslacional, UCLA Center for AIDS Research (CFAR) NIH / NIAID AI028697, la UCLA AIDS Institute, las Herramientas CIRM y el Premio de Tecnología RT1-01126, y el Programa multicampus UC Investigación e Iniciativas de la California Centro para el Descubrimiento de Medicamentos Antivirales (número MRPI-143226).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| PBS | Invitrogen | 10010049 | |
| RPMI 1640 | A1049101 | ||
| Iscove’s | 12440061 | ||
| Fetal Calf Serum | 16000085 | ||
| Collagenase type IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Hyaluronidase | H3506 | ||
| DNAse I | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Piptazo (Zosyn) | Pfizer | Piperacillin/tazobactam combination | |
| Ficoll (Ficoll-Paque Plus) | Ge Healthcare Life Sciences | 17-1440-02 | |
| MACS Buffer | Miltenyi Biotech | See comments | MACS buffer: PBS supplemented with 0.5% fetal bovine serum and 2 mM citrate dextrose formula-A |
| CD34 Microbead Kit | 130-046-702 | ||
| LS Columns | 130-042-401 | ||
| Retronectin | Takara | T100A | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354263 | |
| Isofluorane | Baxter | http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer Animal Health | https://www.rimadyl.com/default.aspx |
References
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