Använda BLT Humaniserad Pigg som en stamcell baserad genterapi tumörmodell
Summary
Alstringen och karakterisering av tumörspecifika T-celler med användning av humaniserade möss beskrivs här. Human tymusvävnad och genetiskt modifierade humana hematopoetiska stamceller transplanteras till nedsatt immunförsvar möss. Detta resulterar i att rekonstituera en manipulerad mänskliga immunsystemet möjliggör in vivo-undersökning av anti-tumör immunsvar.
Abstract
Små djurmodeller såsom möss har i stor utsträckning använts för att studera mänskliga sjukdomar och att utveckla nya terapeutiska interventioner. Trots den stora mängd information som vunnits från dessa studier ledde de unika egenskaperna hos mus immunitet samt artspecificitet av virussjukdomar såsom humant immunbristvirus (HIV) till utveckling av humaniserade musmodeller. De tidigare modellerna involverade användningen av C. B 17 scid / scid möss och transplantation av humana fetala tymus och kallas foster lever din / liv (SCID-hu-) 1, 2 eller adoptiv överföring av humana perifera blodleukocyter (SCID-huPBL ) 3. Båda modellerna huvudsakligen används för att studera HIV-infektion.
En av de viktigaste begränsningarna hos båda dessa modeller var bristen på stabila rekonstitution av humana immunceller i periferin för att göra dem mer fysiologiskt relevant modell för att studera HIV-sjukdom. För detta ändamål BLT humanized musmodell utvecklades. BLT står för benmärg / lever / tymus. I denna modell 6 till 8 veckor gamla NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) nedsatt immunförsvar möss får din / liv implantat som i SCID-hu-musmodell bara för att följas av en andra human hematopoetisk stamcellstransplantation 4. Fördelen med detta system är den fullständiga rekonstitution av det humana immunsystemet i periferin. Denna modell har använts för att studera HIV-infektion och latens 5-8.
Vi har skapat en modifierad version av denna modell som vi använder genetiskt modifierade humana hematopoetiska stamceller (hHSC) att bygga din / liv implantat följt av injektion av transducerade autologa hHSC 7, 9. Detta tillvägagångssätt resulterar i genereringen av genetiskt modifierade linjerna. Ännu viktigare, anpassade vi detta system för att undersöka potentialen att generera funktionella cytotoxiska T-celler (CTL) som uttrycker en melanom specifik T-cellreceptor. Med hjälp av denna modell kunde vi bedöma funktionaliteten hos vår transgen CTL använder levande positronemissionstomografi (PET) avbildning för att bestämma tumörregression (9).
Målet med detta protokoll är att beskriva processen att skapa dessa transgena möss och bedöma effektivitet in vivo med levande PET imaging. Som en anteckning, eftersom vi använder mänskliga vävnader och lentivirusvektorer, våra anläggningar uppfyller CDC NIH riktlinjer för biosäkerhetsnivå 2 (BSL2) med särskilda försiktighetsåtgärder (BSL2 +). Dessutom är NSG mössen allvarligt nedsatt immunförsvar så måste deras boende och underhåll uppfyller de högsta hälsonormer ( http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html ).
Protocol
Representative Results
Discussion
Den modifierade BLT humaniserade musmodell tillsammans med in vivo PET imaging är kraftfulla verktyg för att studera kroniska sjukdomar hos människor. Detta system tar BLT musmodellen och förskott det utöver den begränsade räckvidden för HIV-forskning. Dessutom är det ett bra system där vi kan undersöka olika genterapiprotokoll samt diagnostiska tekniker innan de kan nå den kliniska miljön. Den senare är kopplad med den låga kostnaden för att använda möss kontra primater gör detta till en myc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Alvin Welch och Larry Pang för deras hjälp. Detta arbete har finansierats delvis av National Institutes of Health (NIH) utmärkelse P50 CA086306, California Institute för regenerativ medicin (CIRM) beviljar RC1-00.149-1 och RS1-00.203-1, CIRM ny fakultet Award RN2-00.902-1 , Caltech-UCLA gemensamma Centrum för translationell medicin, UCLA Center för AIDS-forskning (CFAR) NIH / NIAID AI028697, UCLA AIDS Institute, de CIRM verktyg och teknik Award RT1-01.126, och UC Multicampus för forskning och initiativ från California Centrum för antivirala läkemedel Discovery (antal MRPI-143.226).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| PBS | Invitrogen | 10010049 | |
| RPMI 1640 | A1049101 | ||
| Iscove’s | 12440061 | ||
| Fetal Calf Serum | 16000085 | ||
| Collagenase type IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Hyaluronidase | H3506 | ||
| DNAse I | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Piptazo (Zosyn) | Pfizer | Piperacillin/tazobactam combination | |
| Ficoll (Ficoll-Paque Plus) | Ge Healthcare Life Sciences | 17-1440-02 | |
| MACS Buffer | Miltenyi Biotech | See comments | MACS buffer: PBS supplemented with 0.5% fetal bovine serum and 2 mM citrate dextrose formula-A |
| CD34 Microbead Kit | 130-046-702 | ||
| LS Columns | 130-042-401 | ||
| Retronectin | Takara | T100A | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354263 | |
| Isofluorane | Baxter | http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer Animal Health | https://www.rimadyl.com/default.aspx |
References
- McCune, J. M., Namikawa, R., Kaneshima, H., Shultz, L. D., Lieberman, M., Weissman, I. L. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
- Bristol, G. C., Gao, L. Y., Zack, J. A. Preparation and maintenance of SCID-hu mice for HIV research. Methods. 12 (4), 343-347 (1997).
- Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature. 335 (6187), 256-259 (1988).
- Melkus, M. W., Estes, J. D., Padgett-Thomas, A., Gatlin, J., Denton, P. W., Othieno, F. A., Wege, A. K., Haase, A. T., Garcia, J. V. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).
- Denton, P. W., Estes, J. D., Sun, Z., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Powell, D. A., Payne, D., Haase, A. T., Garcia, J. V. Antiretroviral pre-exposure prophylaxis prevents vaginal transmission of HIV-1 in humanized BLT mice. PLoS Med. 5 (1), e16 (2008).
- Sun, Z., Denton, P. W., Estes, J. D., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Melkus, M. W., Padgett-Thomas, M. W. Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4+ T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1. J. Exp. Med. 204 (4), 705-714 (2007).
- Shimizu, S., Hong, P., Arumugam, B., Pokomo, L., Boyer, J., Koizumi, N., Kittipongdaja, P., Chen, A., Bristol, G., Galic, Z., Zack, J. A., Yang, O., Chen, I. S., Lee, B., An, D. S. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
- V, J. Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice. J. Virol. 86 (1), 630-634 (2012).
- Vatakis, D. N., Koya, R. C., Nixon, C. C., Wei, L., Kim, S. G., Avancena, P., Bristol, G., Baltimore, D., Kohn, D. B., Ribas, A., Radu, C. G., Galic, Z., Zack, J. A. Antitumor activity from antigen-specific CD8 T cells generated in vivo from genetically engineered human hematopoietic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (51), 1408-1416 (2011).
