En Optimalisert Prosedyre for fluorescens-aktivert Cell Sorting (FACS) Isolering av Autonome Neural stamfedre fra Visceral organer Fetal Mus
Summary
En optimalisert prosedyre å rense neural crest-avledet nevrale stamceller fra foster mus vev er beskrevet. Denne metoden tar nytte av uttrykk fra fluorescerende reporter alleler å isolere diskrete populasjoner av fluorescens-aktivert celle sortering (FACS). Teknikken kan brukes til å isolere nevrale subpopulasjoner gjennom utvikling eller fra voksne vev.
Abstract
Under utviklingen neural crest (NC)-deriverte nevrale stamceller vandrer bort fra nevralrøret å danne autonome ganglier i viscerale organer som tarm og nedre urinveier. Både under utvikling og i modne vev disse cellene er ofte spredt over hele vev slik at isolering av separate populasjoner med metoder som laser capture mikro-disseksjon er vanskelig. De kan imidlertid være direkte visualisert ved uttrykk av fluorescerende reportere fordrevet fra regulatoriske regioner av nervecellen-spesifikke gener som Tyrosin hydroksylase (TH). Vi beskriver en metode optimalisert for høye avlinger av levedyktige TH + nevrale stamceller fra foster mus viscerale vev, inkludert tarmen og nedre urogenitaltractus (LUT), basert på dissosiasjon og fluorescens-aktivert celle sortering (FACS).
Den Th genet koder hastighetsbegrensende enzym for produksjon av katekolaminer. Enteriske nevrale stamceller begynne å uttrykke TH durbehørig migrasjon i fosterstilling tarmen 1 og TH er også tilstede i en undergruppe av voksne bekken ganglia nerveceller 2-4. Den første opptreden i denne avstamning og fordelingen av disse nevronene i andre deler av LUT, og deres isolasjon har ikke blitt beskrevet. Nevrale stamceller uttrykker TH kan være lett visualiseres ved uttrykk av EGFP i mus som bærer transgene konstruktet Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc en. Vi avbildes uttrykk for dette transgenet i fosterets mus å dokumentere fordelingen av TH + celler i å utvikle LUT på 15,5 dager etter samleie (DPC), utpeking morgenen av plug påvisning som 0,5 DPC, og observert at en undergruppe av nevrale stamceller i fortetting bekken ganglier ekspress EGFP.
For å isolere LUT TH + nevrale stamceller, optimalisert vi metoder som opprinnelig ble brukt til å rense neural crest stamceller fra foster mus tarmen 2-6. Tidligere forsøk på å isolere NC-deriverte populasjoner meget pålitelig ifordøyelse med en cocktail av collagenase og trypsin å få cellesuspensjoner for flowcytometri. I våre hender disse metodene produsert cellesuspensjoner fra LUT med relativt lav levedyktighet. Gitt den allerede lave forekomsten av nevrale stamceller i fosterlivet LUT vev, setter vi ut for å optimalisere dissosiasjon metoder slik at celle overlevelse i de endelige dissosierer skulle økes. Vi fastslått at milde dissosiasjon i Accumax (Innovative Cell Technologies, Inc), manuell filtrering, og flyt kildesortering lavtrykkene tillot oss å oppnå gjennomgående større overlevelse (> 70% av totalt antall celler) med påfølgende avkastning av nevrale stamceller tilstrekkelige for nedstrøms analyse. Metoden beskriver vi kan grovt brukes for å isolere en rekke nevronale populasjoner fra enten føtale eller voksen murine vev.
Protocol
Discussion
Mus reporter linjer uttrykker fluorescerende reportere blir allment tilgjengelig gjennom flere innsats i murine genetikk samfunnet 1,8,9. Som et resultat av dissosiasjon metoden illustrert her kan bli mye brukt for isolering av diskrete nevrale undertyper basert på nevrotransmitteren eller reseptor uttrykk mønstre fra enten føtale eller voksen vev. Mens vi har optimalisert denne metoden basert på uttrykk av et fluorescerende transgenet reporter, kan det også brukes til prøver uttrykker reseptorer på ce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Catherine Alford for forslag på celle dissosiasjon metoder og Kevin Weller, David Flaherty og Brittany Matlock for støtte i flowcytometrisystemer delt ressurs ved Vanderbilt University Medical Center og Melissa A. Musser for kunstnerisk hjelp med illustrasjoner. Vi takker legene. Jack Mosher og Sean Morrison for å få råd om å gjennomføre isolering av nevrale stamceller. VMC flowcytometrisystemer delt ressurs er støttet av Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) og Vanderbilt Digestive Disease Research Center (P30 DK058404). Dette arbeidet ble støttet av midler fra US National Institutes of Health tilskudd DK064251, DK086594, og DK070219.
Materials
| Reagent Name | Vendor | Catalog number | Comments |
| Accumax | Sigma(mfr: Innovative Cell Technologies) | A7089-100ML | Store frozen in 1 ml aliquots |
| DNase I | Sigma | D-4527 | Stored frozen at -20 °C 5 mg/ml in 1xHBSS, (Used in Quench, Quench 1:5) |
| 10X PBS pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter |
| 10X HBSS w/o Ca or Mg | Gibco | 14185-052 | Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 21083027 | |
| Penicillin /Streptomycin 100X | Gibco | 15140-133 | Store aliquoted at -20 °C |
| BSA | Sigma | A3912-100G | Store aliquoted at -20 °C, 100 mg/ml in water |
| Biowhittaker 1M HEPES in 0.85% NaCl | Lonza | 17-737E | |
| 38 μm NITEX Nylon Mesh Membrane | Sefar America | 3-38/22 | Cut into ~3 cm squares. UV treat overnight to sterilize in the tissue culture hood. |
| 7-AAD | Invitrogen | A1310 | 1 mg/ml |
| TRIzol LS | Invitrogen | 10296-028 | |
| 5 ml polystyrene tubes | Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| Fine Dissecting Forceps | Fine Science Instruments | 11251-30 | Dumont#5 forcep, Dumoxel, standard tip 0.1×0.06mm |
| Dissecting Spoon | Fine Science Instruments | 10370-18 |
References
- Gong, S. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
- Kruger, G. M. Neural crest stem cells persist in the adult gut but undergo changes in self-renewal, neuronal subtype potential, and factor responsiveness. Neuron. 35, 657-669 (2002).
- Bixby, S., Kruger, G. M., Mosher, J. T., Joseph, N. M., Morrison, S. J. Cell-intrinsic differences between stem cells from different regions of the peripheral nervous system regulate the generation of neural diversity. Neuron. 35, 643-656 (2002).
- Walters, L. C., Cantrell, V. A., Weller, K. P., Mosher, J. T., Southard-Smith, E. M. Genetic background impacts developmental potential of enteric neural crest-derived progenitors in the Sox10Dom model of Hirschsprung disease. Human Molecular Genetics. , (2010).
- Corpening, J. C. Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression. Genesis. 49, 599-618 (2011).
- Morrison, S. J. . Isolation of fetal rat neural crest stem cells (NCSC) from gut and sciatic nerve. , (2012).
- Skarnes, W. C. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474, 337-342 (2011).
- Harding, S. D. The GUDMAP database–an online resource for genitourinary research. Development. 138, 2845-2853 (2011).
- Joseph, N. M. Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut. J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).
- Newgreen, D. F., Murphy, M. Neural crest cell outgrowth cultures and the analysis of cell migration. Methods Mol. Biol. 137, 201-211 (2000).
