Ett optimerat förfarande för fluorescens-aktiverad cellsortering (FACS) Isolering av autonom neural progenitorer från viscerala organ för Fetala Möss

Summary

En optimerad förfarande för att rena neurallist-härledda neuronala stamceller från foster musvävnader beskrivs. Detta förfarande drar fördel av expression från fluorescerande reportergrupper alleler för att isolera diskreta populationer av fluorescens-aktiverad cellsortering (FACS). Tekniken kan tillämpas för att isolera neuronala subpopulationer genom hela utvecklingen, eller från vävnader från vuxna.

Abstract

Under utveckling neurallisten (NC)-härledda neuronala progenitorceller migrera bort från det neurala röret för att bilda autonom ganglier i inre organ såsom tarmen och nedre urinvägarna. Både under utveckling och mogna vävnader dessa celler är ofta spridda över hela vävnader så att isolering av diskreta populationer med hjälp av metoder som laser capture mikro-dissektion är svårt. De kan emellertid direkt visualiseras genom uttryck av fluorescerande reportrar drivna från regulatoriska regioner av neuron-specifika gener såsom tyrosinhydroxylas (TH). Vi beskriver ett förfarande optimeras för höga utbyten av livskraftiga TH + neuronala progenitorceller från fetala mus viscerala vävnaderna, inklusive tarmen och nedre urogenitalområdet (LUT), baserat på dissociation och fluorescens-aktiverad cellsortering (FACS).

TH-genen kodar det hastighetsbegränsande enzymet för produktion av katekolaminer. Enteriska neuronala stamceller att börja uttrycka TH durning sin vandring i fosterställning tarmen ¹ och TH är också närvarande i en delmängd av vuxna bäcken ganglier neuroner ^2-4. Det första uppträdandet av denna härstamning och fördelningen av dessa neuroner i andra aspekter av LUT och deras isolering har inte beskrivits. Neuronala stamceller uttrycker TH kan lätt visualiseras genom uttryck av EGFP i möss som bär på transgenen konstruktionen Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc ^1. Vi avbildas uttryck för denna transgen i foster möss för att dokumentera fördelningen av TH + celler i utvecklingsländerna LUT vid 15,5 dagar efter coitus (DPC), betecknar morgonen plug-avkänning som 0,5 DPC, och konstaterade att en delmängd av neuronala stamceller i koalescerande bäcken ganglierna express EGFP.

För att isolera LUT TH + neuronala stamceller, optimerad vi metoder som ursprungligen användes för att rena neurala celler crest stamceller från foster musen tarmen ^2-6. Tidigare försök att isolera NC-härledda populationer som åberopasdigerering med en cocktail av kollagenas och trypsin för att erhålla cellsuspensioner för flödescytometri. I våra händer dessa metoder som produceras cellsuspensioner från LUT med relativt låg lönsamhet. Med tanke på den redan låga förekomsten av neuronala stamceller i fostrets LUT vävnader, satte vi ut för att optimera dissociation metoder så att cellöverlevnad i finalen dissocierar skulle ökas. Vi bestämde att milda dissociation i Accumax (Innovativa Cell Technologies, Inc), manuell filtrering, och flödet sortering vid låga tryck får oss att uppnå genomgående större överlevnad (> 70% av totala celler) med efterföljande avkastningen för neuronala stamceller tillräckliga för nedströms analys. Metoden beskriver vi kan i stort sett användas för att isolera en mängd olika neuronala populationer från antingen foster eller en vuxen murina vävnader.

Protocol

1. Beredning av Media (Alla steg sker i vävnadskultur huv) Kombinera följande: 44 ml L-15 medium, 0,5 ml 100 X penicillin / streptomycin (P / S), 0,5 ml 100 mg / ml bovint serumalbumin (BSA), 0,5 ml 1 M HEPES, 5 ml vävnadsodlingskvalitet Vatten. Var noga med att blanda BSA och P / S ordentligt innan du lägger. Denna volym bör vara tillräckligt för dissociation av upp till fem olika vävnader typer. Detta medium kommer att användas i steg 3,4 för att framställa Kyla lösningar för användning efter …

Discussion

Mus reporter som uttrycker fluorescerande reportrar blir allmänt tillgänglig genom flera satsningar på murina genetik samhället ^1,8,9. Som ett resultat av dissociation metod som illustreras här kan tillämpas allmänt för isolering av diskreta neuronala subtyper baserade på neurotransmittor-eller receptor-mönster expressionsvektorer från antingen fetala eller vuxna vävnader. Även om vi har optimerat denna metod, enligt uttryck för en fluorescerande transgen reporter, kan det också tillämpas på …

Materials

Reagent Name	Vendor	Catalog number	Comments
Accumax	Sigma(mfr: Innovative Cell Technologies)	A7089-100ML	Store frozen in 1 ml aliquots
DNase I	Sigma	D-4527	Stored frozen at -20 °C 5 mg/ml in 1xHBSS, (Used in Quench, Quench 1:5)
10X PBS pH 7.4	Gibco	70011-044	Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter
10X HBSS w/o Ca or Mg	Gibco	14185-052	Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter
Leibovitz’s L-15 medium	Gibco	21083027
Penicillin /Streptomycin 100X	Gibco	15140-133	Store aliquoted at -20 °C
BSA	Sigma	A3912-100G	Store aliquoted at -20 °C, 100 mg/ml in water
Biowhittaker 1M HEPES in 0.85% NaCl	Lonza	17-737E
38 μm NITEX Nylon Mesh Membrane	Sefar America	3-38/22	Cut into ~3 cm squares. UV treat overnight to sterilize in the tissue culture hood.
7-AAD	Invitrogen	A1310	1 mg/ml
TRIzol LS	Invitrogen	10296-028
5 ml polystyrene tubes	Falcon	352058
15 ml conical tubes	Corning	430790
Fine Dissecting Forceps	Fine Science Instruments	11251-30	Dumont#5 forcep, Dumoxel, standard tip 0.1×0.06mm
Dissecting Spoon	Fine Science Instruments	10370-18