Produção de seda sintética Aranha em escala de laboratório
Summary
Apesar das propriedades mecânicas excelentes e bioquímicos da aranha sedas, este material não pode ser colhido em grandes quantidades por meios convencionais. Aqui nós descrevemos uma estratégia eficiente para produzir fibras de seda de aranha artificial, que é um processo importante para os investigadores que estudam a produção de seda de aranha e sua utilização como a próxima geração de biomateriais.
Abstract
Como a sociedade progride e os recursos se tornam escassos, está se tornando cada vez mais importante para cultivar novas tecnologias que os biomateriais engenheiro de próxima geração com propriedades de alto desempenho. O desenvolvimento destes novos materiais estruturais deve ser rápida, custo-eficiente e envolvem metodologias de processamento e produtos que sejam ecologicamente corretos e sustentáveis. Aranhas giram uma multidão de diferentes tipos de fibra, com diversas propriedades mecânicas, oferecendo uma rica fonte de materiais de engenharia de última geração para biomimicry que rivalizam com os melhores materiais sintéticos e naturais. Como a coleta de grandes quantidades de seda de aranha natural é impraticável, a produção de seda sintética tem a capacidade de fornecer aos cientistas o acesso a um suprimento ilimitado de tópicos. Portanto, se o processo de fiação pode ser simplificado e aperfeiçoado, fibras artificiais de aranha têm o potencial de uso para uma ampla gama de aplicações que vão desde armaduras, sutura cirúrgicas, cordas e cabos, pneus, cordas para instrumentos musicais, e compósitos para a aviação e tecnologia aeroespacial. A fim de avançar o processo de produção de seda e sintéticos para produzir fibras que exibem variação baixa em suas propriedades materiais de rotação para girar, foi desenvolvido um protocolo de extrusão húmida que integra a expressão de proteínas recombinantes de seda de aranha em bactérias, purificação e concentração das proteínas , seguido por extrusão de fibras e um pós-tratamento de spin-mecânico. Esta é a primeira representação visual que revela um processo de passo-a-passo para girar e analisar fibras de seda artificial numa escala de laboratório. Ele também fornece detalhes para minimizar a introdução de variabilidade entre as fibras fiadas a partir da mesma droga de fiação. Coletivamente, estes métodos irá impulsionar o processo de produção de seda artificial, levando a fibras de alta qualidade que superam as sedas naturais de aranhas.
Introduction
A seda da aranha tem extraordinárias propriedades mecânicas que se realiza vários materiais sintéticos, incluindo aço de alta resistência, Kevlar e Nylon. 1 Spiders girar pelo menos 6-7 diferentes tipos de fibras que exibem diversas propriedades mecânicas, cada um projetado com quantidades variadas de resistência à tração e extensibilidade para executar tarefas específicas biológicos. 2 cientistas da pesquisa são rapidamente buscar a utilização de sedas aranha como biomateriais próxima geração devido às suas excelentes propriedades mecânicas, a sua biocompatibilidade, ea sua natureza não-tóxico e verde-de material. 3,4 Devido à canibalista e natureza venenosa de aracnídeos, a colheita sedas de aranhas através da agricultura não é uma estratégia prática para atender as demandas necessárias para a fabricação em escala industrial. Portanto, os cientistas virou-se para a produção de proteínas recombinantes de seda em organismos transgénicos acoplado com in vitro fiação de fibras sintéticas a partir doproteínas purificadas. si só, 5-8 Expressão de full-length proteínas recombinantes de seda de aranha foi tecnicamente difícil, dadas as propriedades intrínsecas de suas seqüências de genes, que incluem sua natureza altamente repetitiva e comprimentos físicos (> 15 kb), GC-rica de conteúdo e tendenciosa alanina e glicina utilização de codões. 9-11 Até à data, a maioria dos laboratórios têm-se centrado na expressão formas truncadas das proteínas principais ampullate seda MaSp1 ou MaSp2 utilizando sequências parciais de cDNA ou genes sintéticos. 12-15 Spinning sintético aranha sedas é um processo difícil que requer domínio e conhecimento em várias disciplinas científicas, e as complexidades do processo de fiação não foram totalmente revelados ao público em geral pela representação de vídeo. Na verdade, apenas um punhado de laboratórios em todo o mundo têm a expertise para expressar os cDNAs de seda de aranha, purificar as proteínas da seda, girar fibras sintéticas e fazer a pós spin-draw, e, finalmente, testar suas propriedades de biomateriais. 8,16,17 diferentes abordagens para fiação de fibras sintéticas abrangidas fiação úmida e seca, bem como métodos electrospinning 16,18,19 Todos os procedimentos têm um objetivo em comum -. Desenvolvimento de um protocolo que produz seda de aranha sintética com propriedades mecânicas que rivais tópicos naturais para grande escala processos de fabrico comercial.
Aqui descrevemos o procedimento para gerar seda de aranha artificial em escala de laboratório usando uma metodologia de extrusão húmida. Em relação a outros métodos girando, girando molhadas tem produzido os resultados mais consistentes para a análise de fibra. Nós delinear este início procedimento com a expressão das proteínas recombinantes de seda em bactérias, seguido por sua purificação, e, em seguida, descrevem os passos de preparação de proteína para a fiação, incluindo uma metodologia draw pós-rotação aplicado à "tal como fiados" fibras que dá o tópicos com propriedades dos materiais que abordam a qualidade da seda de aranha naturais. Nosso METODOLÓGICASy é projetado para imitar o processo natural de fiação de fibras de seda e baseia a nossa experiência da arquitetura e da função das glândulas produtoras de seda do orbe e cob-aranhas tecendo 20-22. Além disso, podemos concluir com o necessário passos para determinar as propriedades do material das fibras sintéticas usando um tensometer para traçar curvas tensão-deformação, que permitem que os investigadores para calcular a resistência à tracção, a estirpe final, tenacidade e de fibras. Por último, mas de valor significativo, os aparelhos de fiação, o spooling e desenho podem ser construídos em casa usando as peças disponíveis no mercado, ao invés de comprar elaborado e caro equipamento personalizado.
Protocol
Discussion
As fibras sintéticas fiados a partir desta metodologia são mecanicamente sobre a mesma ordem de grandeza em comparação com as fibras naturais. Diminuindo a quantidade de erro humano por mecanização da spooling e processos pós tração de spin, a variação experimental entre as amostras são mais controlada e grandemente reduzida.
A nossa metodologia oferece o potencial para investigar as propriedades mecânicas de outras fibras que são fiados a partir de proteínas recombinantes cod…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela NSF RUI Grants MCB-0950372 e 1105310 DMR-intitulado "Caracterização Molecular de Silks aranha viúva negra e comportamento mecânico de Spider Silks cola", respectivamente.
Materials
| Reagent/Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| pBAD/TOPO ThioFusion Expression Kit | Invitrogen | K370-01 | |
| FastBreak Cell Lysis Reagent, 10x | Promega | V857C | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | Includes instructions for buffers |
| ProteoSilver Silver Stain Kit | Sigma-Aldrich | PROTSIL1-1KT | |
| FreeZone Lyophilizer | Labconco | 7960041 | FreeZone 12Plus |
| Hexafluoroisopropanol (HFIP) | Sigma-Aldrich | 52512 | |
| Syringe | Hamilton | 7657-01 | 250 μL |
| Needle | Hamilton | 7780-01 | 26s Gauge, Blunt end removable needle |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702208 | 11Plus |
| Digital Caliper | Carrera | CP5906 | 0-150 mm range |
| Stainless steel forceps | World Precision Instruments | 501764 | Mini Dumont #M5S |
| Motor | Nature Mill | 7090529 | 12VDC, 2 rpm speed |
| Linear Actuator | Warner Electric | 01-D024-0050-A06-LP-IP65 | 24VDC, 6 inch range |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16 | |
| Digital microscope camera | Leica Microsystems | DFC320 | Software: Leica Application Suite v2.8.1 |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | 500260 | |
| Microtensometer | Aurora Scientific | 310C | 5N Dual-Mode System |
References
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