Syntetisk Spider Silk Produksjonen på en laboratorieskala

Summary

Til tross for de fremragende mekaniske og biokjemiske egenskaper edderkopp silke, kan dette materialet ikke kan høstes i store mengder på konvensjonell måte. Her beskriver vi en effektiv strategi for å spinne kunstige edderkopp silke fiber, som er en viktig prosess for etterforskerne som studerte edderkopp silke produksjon og deres bruk som neste generasjons biomaterialer.

Abstract

Som samfunn utvikler seg og ressursene blir knappere, er det stadig viktigere å dyrke nye teknologier som ingeniør neste generasjons biomaterialer med høy ytelse egenskaper. Utviklingen av disse nye strukturelle materialer må være rask, kostnadseffektiv og involvere prosessering metoder og produkter som er miljøvennlige og bærekraftige. Edderkopper spinner en rekke forskjellige fibertyper med ulike mekaniske egenskaper, og tilbyr en rik kilde til neste generasjons ingeniører materialer for biomimicry som konkurrerer med de beste menneskeskapte og naturlige materialer. Siden samlingen av store mengder naturlig edderkopp silke er upraktisk, har syntetisk silke produksjon evnen til å gi forskere med tilgang til en ubegrenset tilførsel av tråder. Derfor, hvis spinnende prosessen kan være strømlinjeformet og perfeksjonert, kunstige edderkopp fibre har potensial bruk for et bredt spekter av applikasjoner som spenner fra kroppen rustning, kirurgisk suturs, tau og kabler, dekk, strenger for musikkinstrumenter, og kompositter for luftfart og romfart teknologi. For å fremme syntetisk silke produksjonsprosessen og for å gi fibre som viser lav varians i sine materialegenskaper fra spinn til å spinne, utviklet vi en våt-spinning-protokollen som integrerer uttrykket av rekombinante edderkopp silke proteiner i bakterier, rensing og konsentrasjon av proteiner , etterfulgt av fiber ekstrudering og en mekanisk post-spinn behandling. Dette er det første visuelle representasjonen som avslører en steg-for-steg prosess for å spinne og analysere kunstsilke fiber på et laboratorium skala. Det gir også informasjon for å minimalisere introduksjon av variasjonen blant fibre spunnet av samme spinnende dop. Samlet vil disse metodene drive prosessen med kunstsilke produksjon, fører til høyere kvalitet fibre som overgår naturlig edderkopp silke.

Introduction

Edderkopp silke har ekstraordinære mekaniske egenskaper som utkonkurrerer flere menneskeskapte materialer, inkludert høyfast stål, kevlar og nylon. ¹ edderkopper spinner minst 6-7 forskjellige fibertyper som viser ulike mekaniske egenskaper, hver er utformet med varierende mengder strekkstyrke og utvidelsesmuligheter til å utføre bestemte biologiske oppgaver. ² forskerne raskt forfølge bruk av edderkoppen silke som neste generasjons biomaterialer grunn av sine fremragende mekaniske egenskaper, deres biokompatibilitet, og deres ikke-giftig og grønn-materiale natur. ^3,4 grunn av kannibalistiske og giftigste natur edderkoppdyr, høsting edderkopp silke gjennom landbruk er ikke en praktisk strategi for å møte kravene som er nødvendige for industriell skala produksjon. Derfor har forskere slått til produksjon av rekombinante silke proteiner i transgene organismer kombinert med in vitro spinning av syntetiske fibre fraSE rensede proteiner. ^5-8 Expression av full-lengde rekombinante edderkopp silke proteiner har vært teknisk vanskelig gitt de iboende egenskapene til sine gensekvenser, som inkluderer deres svært repeterende natur og fysiske lengde (> 15 kb), GC-rikt innhold og partisk alanin og glycin kodon bruk. ^9-11 Hittil har de fleste labs fokusert på å uttrykke avkortede former for de store ampullate silke proteiner MaSp1 eller MaSp2 bruker ufullstendige cDNA sekvenser eller syntetiske gener. ^12-15 Spinning syntetisk edderkopp silke er en utfordrende prosess som krever mestring og kunnskap i flere vitenskapelige disipliner, og vanskelighetene med å spinne prosessen ikke har vært fullt avslørt for allmennheten ved video representasjon. Faktisk bare en håndfull laboratorier over hele verden har kompetanse til å uttrykke edderkopp silke cDNAs, rense silke proteiner, spinne syntetiske fibre og utføre post-spin uavgjort, og til slutt teste sine biomateriale egenskaper. ^8,16,17 Ulike tilnærminger for spinning syntetiske fibre har omfattet våte og tørre spinnende samt electrospinning metoder ^16,18,19 Alle prosedyrer har ett mål i felles -. Utvikling av en protokoll som produserer syntetisk edderkopp silke med mekaniske egenskaper som rivaliserende naturlige tråder for storskala kommersielle produksjonsprosesser.

Her beskriver vi fremgangsmåten for å generere kunstige edderkopp silke på et laboratorium skala ved hjelp av en våt-spinning metodikk. I forhold til andre spinnende metoder, har våte spinnende produsert de mest konsistente resultatene for fiber analyse. Vi fremgangsmåte som begynner med uttrykket av de rekombinante silke proteiner i bakterier, etterfulgt av rensing deres, og deretter beskrive protein forberedelse trinn for spinning, inkludert en post-spin uavgjort metode brukes til "as-spunnet" fibre som gir tråder med materialegenskaper som nærmer kvaliteten av naturlige spider silke. Vår methodology er designet for å nøye etterligne den naturlige spinnende prosessen med silke fiber og den trekker tungt på vår kompetanse på arkitektur og funksjon av silke-produserende kjertler fra kule-og cob-veving edderkopper. ^20-22 Videre konkluderer vi med nødvendig fremgangsmåten for å fastslå de materielle egenskapene til de syntetiske fibrene ved hjelp av en tensometer å plotte stress-tøyningskurver, som tillater etterforskere å beregne den ultimate styrke, ultimate belastning, og seighet av fiber. Til slutt, men av betydelig verdi, kan det roterende, spoling, og tegning apparater være hjemme-bygget ved hjelp av kommersielt tilgjengelige deler, snarere enn å kjøpe forseggjort og kostbar tilpasset utstyr.

Protocol

Grafisk oversikt: Biomimicry av Spinning Process Biomimicry av den naturlige edderkopp silke produksjon vei:. En rute for å produsere syntetisk silke Dette bildet viser den store ampullate kjertel fra den gylne orb Weaver, Nephila clavipes, og komponentene benyttes for naturlig silke produksjon (hvit tekst). Halen regionen syntetiserer store mengder silke proteiner som transporte…

Discussion

Syntetiske fibre spunnet av denne metodikken er mekanisk på samme størrelsesorden i forhold til de naturlige fibre. Ved å redusere mengden av menneskelig feil ved mechanizing spolingskatalogen og post spin draw prosesser, eksperimentell variasjon mellom prøvene er mer kontrollert og sterkt redusert.

Vår metodikk har potensial til å undersøke de mekaniske egenskapene til andre fibre som er spunnet av rekombinante proteiner kodet fra de cDNAs andre medlemmer av edderkopp genet familie. …

Materials

Reagent/Equipment	Company	Catalogue number	Comments
pBAD/TOPO ThioFusion Expression Kit	Invitrogen	K370-01
FastBreak Cell Lysis Reagent, 10x	Promega	V857C
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30210	Includes instructions for buffers
ProteoSilver Silver Stain Kit	Sigma-Aldrich	PROTSIL1-1KT
FreeZone Lyophilizer	Labconco	7960041	FreeZone 12Plus
Hexafluoroisopropanol (HFIP)	Sigma-Aldrich	52512
Syringe	Hamilton	7657-01	250 μL
Needle	Hamilton	7780-01	26s Gauge, Blunt end removable needle
Syringe Pump	Harvard Apparatus	702208	11Plus
Digital Caliper	Carrera	CP5906	0-150 mm range
Stainless steel forceps	World Precision Instruments	501764	Mini Dumont #M5S
Motor	Nature Mill	7090529	12VDC, 2 rpm speed
Linear Actuator	Warner Electric	01-D024-0050-A06-LP-IP65	24VDC, 6 inch range
Dissecting microscope	Leica Microsystems	Leica MZ16
Digital microscope camera	Leica Microsystems	DFC320	Software: Leica Application Suite v2.8.1
Vannas scissors	World Precision Instruments	500260
Microtensometer	Aurora Scientific	310C	5N Dual-Mode System