一个的趋电含量为神经前体细胞迁移的动力学分析外部施加直流电场

Summary

在这个协议中，我们将演示如何构建自定义室，允许应用程序的直流电场，使时间的推移成像的成人脑源性神经前体细胞转趋电性。

Abstract

神经干细胞和祖细胞（统称为神经前体细胞）（的NPC）在成年哺乳动物大脑的发现已导致一个机构的研究，目的是在利用这些细胞的多能和增殖特性的发展的神经再生策略。这种战略成功的一个关键步骤是动员的NPC外源性移植后向病变部位或提高内源性的前体，发现脑室周围白质区域的中枢神经系统的反应。因此，有必要了解的机制，促进，引导，增强人大迁移。我们的工作主要集中在利用直流电场（量增多），以促进和直接的NPC迁移 – 这种现象被称为趋电性。内源性生理电场的正常发育和伤口修复细胞迁移过程中发挥作用的关键线索。药理中断在蝾螈胚胎的的跨神经管潜力会导致严重的发育畸形。的速度修复受伤的角膜伤口愈合的情况下，直接与上皮损伤后产生的伤害潜力的幅度，药理增强或中断，这DCEF ^2-3所示。我们已经证明，成年室管膜下的NPC进行快速和导演的阴极迁移的影响 ，当暴露在外部施加的dcEF。在这个协议中，我们将介绍创建一个简单而有效的高分辨率，长期观察的细胞体易位（迁移）在单细胞水平的趋电检测实验室的技术。该测定中，将适合于调查机制调节dcEF转导到细胞运动通过使用转基因或基因敲除小鼠，短干扰RNA，或特定的受体激动剂/拮抗剂。

Protocol

多伦多大学的动物保健委员会批准了在所有涉及动物处理的程序，按照制度指引（协议。20009387）。应当执行下面的方法，使用无菌的工具和技术，在层流罩（如适用）。 在下面的协议文本中，短语“EFH-SFM”是指以与表皮生长因子，碱性成纤维细胞生长因子和肝素的无血清培养基中。 EFH-SFM调查时，未分化的NPC，因为这些有丝分裂原的趋电维持其未分化状态的NPC 4。?…

Representative Results

运动学分析表明，在250毫伏/毫米dcEF的存在下，未分化的NPC表现出高度定向和快速的趋电向阴极（ 图5A，电影1）。在一个dcEF缺席，随机运动的细胞中观察到（ 图5B，电影2）。在此输入强度，> 98％的未分化的NPC迁移整个6-8小时，这是他们的成像，并自死细胞不迁移，这表明，它们在此期间，在存在或不存在的dcEF仍然可行。 有区别的表型进行可以忽…

Discussion

该协议已经进行了调整，从以前的研究^7-9的行之有效的方法。可以使用各种不同的技术，包括建造一个单独的玻璃以及禁闭细胞接种中部槽^10,11的微细化，或使用CO ₂激光烧蚀构造galvanotactic室。有些技术可能比别人更费力，代价高昂的。我们描述了一个简单和成本效益的分析，为构建全国人民代表大会趋电性室使用的材料通常存在于大多数细胞生物学实验室。我们的协议，…

Materials

Name of item	Company	Catalogue number	Comments
			Neural Precursor Cell Isolation
2M NaCl	Sigma	S5886	11.688 g dissolved in 100 ml dH2O
1M KCl	Sigma	P5405	7.456 g dissolved in 100 ml dH2O
1M MgCl2	Sigma	M2393	20.33 g dissolved in 100 ml dH2O
155 mM NaHCO3	Sigma	S5761	1.302 g dissolved in 100 ml dH2O
0.5M Glucose	Sigma	G6152	9.01 g dissolved in 100 ml dH2O
108 mM CaCl2	Sigma	C7902	1.59 g dissolved in 100 ml dH2O
Penicillin-streptomycin	Gibco	15070
Bovine pancreas trypsin	Sigma	T1005
Sheep testes hyaluronidase	Sigma	H6254
Kynurenic acid	Sigma	K3375
Ovomucoid trypsin inhibitor	Worthington	LS003086
DMEM	Invitrogen	12100046
F12	Invitrogen	21700075
30% Glucose	Sigma	G6152
7.5% NaHCO3	Sigma	S5761
1M HEPES	Sigma	H3375	23.83 g dissolved in 100 ml dH2O
L-glutamine	Gibco	25030
EGF	Invitrogen	PMG8041	Reconstitute in 1 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
FGF	Invitrogen	PHG0226	Reconstitute in 0.5 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
Heparin	Sigma	H3149
Apo-transferrin	R&D Systems	3188-AT	0.1 g dissolved into 4 ml dH20
Putrescine	Sigma	P7505	Dissolve 9.61 mg into Apo-transferrin solution
Insulin	Sigma	I5500	Dissolve 25 mg into 0.5 ml of 0.1N HCl and add to 3.5 ml of dH20
Selenium	Sigma	S9133
Progesterone	Sigma	P6149
Standard Dissection Tools	Fine Science Tools
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000
			Galvanotaxis Chamber Preparation
Square glass cover slides	VWR	16004
6N Hydrochloric Acid	VWR	BDH3204-1
High vacuum grease	Dow Corning
60 mm Petri dishes	Fisher Scientific	0875713A
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Matrigel	BD Biosciences	354234	Thaw and aliquot into 150 μl units
FBS	Invitrogen	10082139	Only use if inducing NPC differentiation, otherwise use SFM + EFH culture media as indicated above
Counting microscope	Olympus	CKX41
			Live Cell Time-Lapse Imaging
Silver wire	Alfa Aesar	11434
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-027
Heat Inactivated FBS	Sigma	16140071
PVC tubing	Fisher Scientific	80000006	3/32″ID x 5/32″OD
Bleach	Clorox
10 cc syringe	BD	309604
18 gauge needle	BD	305195
Dremel drill	Dremel	Model 750
Inverted microscope equipped with humidified, incubated chamber	Zeiss	Axiovert-200M
			Recipes Item Volume 2M NaCl 6.2 ml 1M KCl 0.5 ml 1M MgCl2 0.32 ml 155mM NaHCO3 16.9 ml 1M Glucose 1 ml 108 mM CaCl2 0.09256 ml Penicillin-streptomycin 1 ml Autoclaved water 74 ml Artificial cerebrospinal fluid Item Volume or Mass Artificial cerebrospinal fluid 30 ml Bovine pancreas trypsin 40 mg Sheep testes hyaluronidase 22.8 mg Kynurenic acid 5 mg Trypsin Solution Item Volume or Mass SFM 15 ml Ovomucoid trypsin inhibitor 10 mg Trypsin Inhibitor Solution Item Volume Autoclaved water 37 ml 10X DMEM/F12 10 ml 30% Glucose 2 ml 7.5% NaHCO3 1.5 ml 1M HEPES 0.5 ml Transferrin, Putrescine solution 4 ml 25 mg insulin solution 4 ml Selenium 100 μl Progesterone 100 μl Hormone Mix (100 ml total, store at -20 °C) Item Volume Autoclaved water 37.5 ml 10X DMEM/F12 (3:1) 5 ml 30% Glucose 1 ml 7.5% NaHCO3 0.75 ml 1M HEPES 0.25 ml Hormone mix 5 ml L-glutamine 0.5 ml Penicillin-streptomycin 0.5 ml Serum Free Media EFH-SFM: add 10 μl of EGF, 10 μl of FGF, and 3.66 μl of Heparin FBS-SFM: add 0.5 ml FBS Item Volume Matrigel 150 μl SFM 3.6 ml Matrigel Solution Matrigel aliquot should be placed in a box of ice and allowed to thaw slowly over 4-5 hours to form a viscous liquid before mixing with SFM. This will ensure the formation of a smooth layer of Matrigel substrate. If not thawed slowly, the resulting substrate will contain clumps of Matrigel, possibly hindering cell migration. Item Volume or Mass UltraPure Agarose 300 mg in 10 ml ddH20 SFM Heat Inactivated FBS 8 ml 2 ml Matrigel Solution Mix 8 ml of SFM with 2 ml heat inactivated FBS in a 15 cc falcon tube. Mix agarose with 10 ml ddH20 in an Erlenmeyer flask, and heat in a microwave for 30 sec in 10-sec intervals, ensuring to remove the solution from the microwave after each 10-sec interval and thoroughly mix. Following the final 10-sec microwave period, mix the agarose solution with the SFM/FBS solution and store in a 57 °C water bath.