En Galvanotaxis analys för analys av neurala Migration prekursorcell Kinetik i en extern Applied likström Electric Field

Summary

I detta protokoll visar vi hur man konstruerar egna kammare som tillåter tillämpningen av en likström elektriskt fält för att möjliggöra time-lapse avbildning av vuxna hjärnan härrör neurala translokation prekursorcell under galvanotaxis.

Abstract

Upptäckten av neurala stam-och stamfaderceller (kollektivt benämnda neurala prekursorceller) (NPC) i den vuxna däggdjur hjärnan har lett till en mängd forskning som syftar till att utnyttja de multipotenta och proliferativa egenskaperna hos dessa celler för utveckling av neuroregenerative strategier. Ett kritiskt steg för att lyckas med sådana strategier är att mobilisera NPC mot en lesion plats efter exogent transplantation eller för att öka responsen av de endogena prekursorer som finns i periventrikulär området av CNS. Därför är det viktigt att förstå de mekanismer som främjar, vägleda och förbättra NPC migration. Vårt arbete fokuserar på utnyttjandet av likström elektriska fält (dcEFs) för att främja och direkt NPC migration – ett fenomen som kallas galvanotaxis. Endogena fysiologiska elektriska fält fungerar som kritiska ledtrådar för cellmigrering under normal utveckling och sårläkning. Farmakologisk störning avtrans-neuralrörsdefekter potential i Axolotl embryon orsakar allvarliga utvecklingsstörningar missbildningar ^1. I samband med sårläkning, är graden av reparation av skadade hornhinnan direkt korrelerad med storleken på epiteliala sår potential som uppstår efter skada, vilket framgår av farmakologisk förbättring eller avbrott i denna dcEF ^2-3. Vi har visat att vuxna subependymala NPC genomgår en snabb och riktad katod migration in vitro när de utsätts för en externt applicerad dcEF. I detta protokoll beskriver vi vår labs tekniker för att skapa en enkel och effektiv galvanotaxis analys för högupplöst långsiktigt observation av riktad cellkroppen translokation (migration) på en enda cellnivå. Denna analys skulle vara lämplig för att undersöka de mekanismer som reglerar dcEF transduktion till cellulär motilitet genom användning av transgena eller knockout-möss, korta interfererande RNA, eller specifika receptoragonister / antagonister.

Protocol

Alla förfaranden som rör djurhantering godkändes av University of Toronto Animal Care kommittén i enlighet med institutionella riktlinjer (protokoll nr. 20.009.387). Följande metoder bör utföras med sterila verktyg och tekniker, i ett dragskåp med laminärt flöde i förekommande fall. I protokollet texten nedan, hänvisar uttrycket "EFH-SFM" till serumfria media kompletterade med epidermal tillväxtfaktor, basisk fibroblasttillväxtfaktor och heparin. EFH-SFM används när…

Representative Results

Kinematisk analys avslöjar att i närvaro av en 250 mV / mm dcEF, odifferentierade NPC uppvisar starkt riktade och snabba galvanotaxis mot katoden (figur 5A, film 1). I avsaknad av en dcEF, är slumpmässig rörelse av cellerna observerades (figur 5B, film 2). Vid denna fältstyrka,> 98% av odifferentierade NPC migrerar för hela 6-8 h för vilka de avbildas, och eftersom döda celler inte migrerar detta tyder på att de förblir livskraftiga under denna period i frånvaro eller nä…

Discussion

Detta protokoll har anpassats från väletablerade metoder för tidigare studier ^7-9. Galvanotactic kammare kan konstrueras med användning av en mängd olika tekniker, inklusive byggandet av en separat glas väl för inneslutning av cellsådd, eller använda CO ₂ laserablation för mikrotillverkning av den centrala tråget ^10,11. Vissa tekniker kan vara mer arbetskrävande eller kostsam än andra. Vi har beskrivit en enkel och kostnadseffektiv analys för att bygga en NPC galvanotaxis k…

Materials

Name of item	Company	Catalogue number	Comments
			Neural Precursor Cell Isolation
2M NaCl	Sigma	S5886	11.688 g dissolved in 100 ml dH2O
1M KCl	Sigma	P5405	7.456 g dissolved in 100 ml dH2O
1M MgCl2	Sigma	M2393	20.33 g dissolved in 100 ml dH2O
155 mM NaHCO3	Sigma	S5761	1.302 g dissolved in 100 ml dH2O
0.5M Glucose	Sigma	G6152	9.01 g dissolved in 100 ml dH2O
108 mM CaCl2	Sigma	C7902	1.59 g dissolved in 100 ml dH2O
Penicillin-streptomycin	Gibco	15070
Bovine pancreas trypsin	Sigma	T1005
Sheep testes hyaluronidase	Sigma	H6254
Kynurenic acid	Sigma	K3375
Ovomucoid trypsin inhibitor	Worthington	LS003086
DMEM	Invitrogen	12100046
F12	Invitrogen	21700075
30% Glucose	Sigma	G6152
7.5% NaHCO3	Sigma	S5761
1M HEPES	Sigma	H3375	23.83 g dissolved in 100 ml dH2O
L-glutamine	Gibco	25030
EGF	Invitrogen	PMG8041	Reconstitute in 1 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
FGF	Invitrogen	PHG0226	Reconstitute in 0.5 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
Heparin	Sigma	H3149
Apo-transferrin	R&D Systems	3188-AT	0.1 g dissolved into 4 ml dH20
Putrescine	Sigma	P7505	Dissolve 9.61 mg into Apo-transferrin solution
Insulin	Sigma	I5500	Dissolve 25 mg into 0.5 ml of 0.1N HCl and add to 3.5 ml of dH20
Selenium	Sigma	S9133
Progesterone	Sigma	P6149
Standard Dissection Tools	Fine Science Tools
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000
			Galvanotaxis Chamber Preparation
Square glass cover slides	VWR	16004
6N Hydrochloric Acid	VWR	BDH3204-1
High vacuum grease	Dow Corning
60 mm Petri dishes	Fisher Scientific	0875713A
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Matrigel	BD Biosciences	354234	Thaw and aliquot into 150 μl units
FBS	Invitrogen	10082139	Only use if inducing NPC differentiation, otherwise use SFM + EFH culture media as indicated above
Counting microscope	Olympus	CKX41
			Live Cell Time-Lapse Imaging
Silver wire	Alfa Aesar	11434
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-027
Heat Inactivated FBS	Sigma	16140071
PVC tubing	Fisher Scientific	80000006	3/32″ID x 5/32″OD
Bleach	Clorox
10 cc syringe	BD	309604
18 gauge needle	BD	305195
Dremel drill	Dremel	Model 750
Inverted microscope equipped with humidified, incubated chamber	Zeiss	Axiovert-200M
			Recipes Item Volume 2M NaCl 6.2 ml 1M KCl 0.5 ml 1M MgCl2 0.32 ml 155mM NaHCO3 16.9 ml 1M Glucose 1 ml 108 mM CaCl2 0.09256 ml Penicillin-streptomycin 1 ml Autoclaved water 74 ml Artificial cerebrospinal fluid Item Volume or Mass Artificial cerebrospinal fluid 30 ml Bovine pancreas trypsin 40 mg Sheep testes hyaluronidase 22.8 mg Kynurenic acid 5 mg Trypsin Solution Item Volume or Mass SFM 15 ml Ovomucoid trypsin inhibitor 10 mg Trypsin Inhibitor Solution Item Volume Autoclaved water 37 ml 10X DMEM/F12 10 ml 30% Glucose 2 ml 7.5% NaHCO3 1.5 ml 1M HEPES 0.5 ml Transferrin, Putrescine solution 4 ml 25 mg insulin solution 4 ml Selenium 100 μl Progesterone 100 μl Hormone Mix (100 ml total, store at -20 °C) Item Volume Autoclaved water 37.5 ml 10X DMEM/F12 (3:1) 5 ml 30% Glucose 1 ml 7.5% NaHCO3 0.75 ml 1M HEPES 0.25 ml Hormone mix 5 ml L-glutamine 0.5 ml Penicillin-streptomycin 0.5 ml Serum Free Media EFH-SFM: add 10 μl of EGF, 10 μl of FGF, and 3.66 μl of Heparin FBS-SFM: add 0.5 ml FBS Item Volume Matrigel 150 μl SFM 3.6 ml Matrigel Solution Matrigel aliquot should be placed in a box of ice and allowed to thaw slowly over 4-5 hours to form a viscous liquid before mixing with SFM. This will ensure the formation of a smooth layer of Matrigel substrate. If not thawed slowly, the resulting substrate will contain clumps of Matrigel, possibly hindering cell migration. Item Volume or Mass UltraPure Agarose 300 mg in 10 ml ddH20 SFM Heat Inactivated FBS 8 ml 2 ml Matrigel Solution Mix 8 ml of SFM with 2 ml heat inactivated FBS in a 15 cc falcon tube. Mix agarose with 10 ml ddH20 in an Erlenmeyer flask, and heat in a microwave for 30 sec in 10-sec intervals, ensuring to remove the solution from the microwave after each 10-sec interval and thoroughly mix. Following the final 10-sec microwave period, mix the agarose solution with the SFM/FBS solution and store in a 57 °C water bath.