Dıştan Uygulanan Doğru Akım Elektrik Alanında Nöral Prekürsör Hücre Göç Kinetik Analizi için galvanotaksis Assay

Summary

Bu protokolü biz galvanotaksis sırasında nöral prekürsör hücre translokasyon edilen erişkin beyninin time-lapse görüntüleme sağlamak için bir doğru akım elektrik alanın uygulanmasına izin özel odaları oluşturmak nasıl gösterilmektedir.

Abstract

Nöral kök ve erişkin memeli beynindeki progenitor hücreler (toplu olarak adlandırılır sinir öncü hücreleri) (NPC) keşfedilmesi neuroregenerative stratejilerin geliştirilmesi için bu hücrelerin multipotent ve proliferatif özellikler kullanılarak yönelik araştırmalar bir gövde yol açmıştır. Bu tür stratejilerin başarısı için kritik bir adım eksojen Transplantasyon sonrası lezyon yerinde doğru veya MSS periventriküler bölgede bulunan endojen öncüleri yanıtı arttırmak için NPCs harekete geçirilmesidir. Buna göre, teşvik rehberlik ve NPC göç geliştirmek mekanizmaları anlamak için önemlidir. Galvanotaksis olarak bilinen bir olgu – Bizim iş tanıtmak için doğru akım elektrik alanların kullanımı (dcEFs) ve doğrudan NPC göç üzerinde duruluyor. Endojen fizyolojik elektrik alanları normal gelişimi ve yara onarımı sırasında hücre göçü için kritik ipuçları olarak işlev görür. Farmakolojik bozulmasıAxolotl embriyolar trans-nöral tüp potansiyeli ciddi gelişimsel malformasyonlar ¹ neden olur. Yara iyileştirme bağlamında, yaralı, kornea tamir oranı doğrudan bu dcEF ^2-3 farmakolojik olarak artırma ya da bozulma ile gösterildiği gibi, yaralanma sonrası ortaya çıkan epitel yara potansiyel büyüklüğü ile ilişkilidir. Biz bir şekilde dıştan uygulanan dcEF maruz kaldığında yetişkin subepandimal YZK'lar in vitro hızlı ve yönetmenliğini cathodal göç tabi olduğunu göstermiştir. Bu protokolü biz yüksek çözünürlüklü, bir tek hücre düzeyinde yönettiği hücre gövdesi translokasyon (göç) uzun vadeli gözlem için basit ve etkili bir galvanotaksis tahlil oluşturmak için laboratuvar tekniklerini açıklar. Bu tahlil, transgenik veya nakavt fareleri kısa müdahale RNA, ya da özel bir reseptör agonistleri / antagonistleri kullanımı yoluyla hücre hareketliliği içine dcEF transdüksiyon düzenleyen mekanizma araştırılması için uygun olacaktır.

Protocol

Hayvan taşıma içeren tüm prosedürler kurumsal düzenlemeler (protokol no. 20009387) uyarınca Toronto Hayvan Bakım Komitesince Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Aşağıdaki yöntemler uygulanabilir durumlarda bir laminer akış kaputu, steril alet ve teknikler kullanılarak yapılmalıdır. Aşağıdaki protokol metninde, ifade "EFH-SFM" epidermal büyüme faktörü, temel fibroblast büyüme faktörü ve heparin ile takviye serum serbest medya anlamına gelir. Bu …

Representative Results

Kinematik analizi bir 250 mV / mm dcEF varlığında, farklılaşmamış NPC katot karşı yönlendirilmiş ve çok hızlı galvanotaksis (Şekil 5A, Film 1) gösterdiğini ortaya koymaktadır. Bir dcEF yokluğunda, hücrelerin rasgele hareketi (Şekil 5B, Film 2) görülmektedir. Bu alan gücü az, farklılaşmamış NPCs>% 98'i yansıması olduğu için tüm 6-8 saat boyunca göç ve ölü hücreleri göç etmezler çünkü bu bir dcEF yokluğunda veya varlığında bu dönemde…

Discussion

Bu protokol, önceki çalışmalarda ^7-9 köklü yöntemler adapte edilmiştir. Galvanotactic odaları hücre ekimi kısıtlanmasının veya merkez çukur ^10,11 mikroimalat için _CO2 lazer ablasyonu kullanmak için de ayrı bir cam yapım dahil olmak üzere farklı teknikler kullanarak çeşitli inşa edilebilir. Bazı teknikler diğerlerinden daha zahmetli ve masraflı olabilir. Biz genellikle çoğu hücre biyoloji laboratuvarlarında bulunan malzemeler kullanılarak bir NPC galvanotak…

Materials

Name of item	Company	Catalogue number	Comments
			Neural Precursor Cell Isolation
2M NaCl	Sigma	S5886	11.688 g dissolved in 100 ml dH2O
1M KCl	Sigma	P5405	7.456 g dissolved in 100 ml dH2O
1M MgCl2	Sigma	M2393	20.33 g dissolved in 100 ml dH2O
155 mM NaHCO3	Sigma	S5761	1.302 g dissolved in 100 ml dH2O
0.5M Glucose	Sigma	G6152	9.01 g dissolved in 100 ml dH2O
108 mM CaCl2	Sigma	C7902	1.59 g dissolved in 100 ml dH2O
Penicillin-streptomycin	Gibco	15070
Bovine pancreas trypsin	Sigma	T1005
Sheep testes hyaluronidase	Sigma	H6254
Kynurenic acid	Sigma	K3375
Ovomucoid trypsin inhibitor	Worthington	LS003086
DMEM	Invitrogen	12100046
F12	Invitrogen	21700075
30% Glucose	Sigma	G6152
7.5% NaHCO3	Sigma	S5761
1M HEPES	Sigma	H3375	23.83 g dissolved in 100 ml dH2O
L-glutamine	Gibco	25030
EGF	Invitrogen	PMG8041	Reconstitute in 1 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
FGF	Invitrogen	PHG0226	Reconstitute in 0.5 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
Heparin	Sigma	H3149
Apo-transferrin	R&D Systems	3188-AT	0.1 g dissolved into 4 ml dH20
Putrescine	Sigma	P7505	Dissolve 9.61 mg into Apo-transferrin solution
Insulin	Sigma	I5500	Dissolve 25 mg into 0.5 ml of 0.1N HCl and add to 3.5 ml of dH20
Selenium	Sigma	S9133
Progesterone	Sigma	P6149
Standard Dissection Tools	Fine Science Tools
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000
			Galvanotaxis Chamber Preparation
Square glass cover slides	VWR	16004
6N Hydrochloric Acid	VWR	BDH3204-1
High vacuum grease	Dow Corning
60 mm Petri dishes	Fisher Scientific	0875713A
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Matrigel	BD Biosciences	354234	Thaw and aliquot into 150 μl units
FBS	Invitrogen	10082139	Only use if inducing NPC differentiation, otherwise use SFM + EFH culture media as indicated above
Counting microscope	Olympus	CKX41
			Live Cell Time-Lapse Imaging
Silver wire	Alfa Aesar	11434
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-027
Heat Inactivated FBS	Sigma	16140071
PVC tubing	Fisher Scientific	80000006	3/32″ID x 5/32″OD
Bleach	Clorox
10 cc syringe	BD	309604
18 gauge needle	BD	305195
Dremel drill	Dremel	Model 750
Inverted microscope equipped with humidified, incubated chamber	Zeiss	Axiovert-200M
			Recipes Item Volume 2M NaCl 6.2 ml 1M KCl 0.5 ml 1M MgCl2 0.32 ml 155mM NaHCO3 16.9 ml 1M Glucose 1 ml 108 mM CaCl2 0.09256 ml Penicillin-streptomycin 1 ml Autoclaved water 74 ml Artificial cerebrospinal fluid Item Volume or Mass Artificial cerebrospinal fluid 30 ml Bovine pancreas trypsin 40 mg Sheep testes hyaluronidase 22.8 mg Kynurenic acid 5 mg Trypsin Solution Item Volume or Mass SFM 15 ml Ovomucoid trypsin inhibitor 10 mg Trypsin Inhibitor Solution Item Volume Autoclaved water 37 ml 10X DMEM/F12 10 ml 30% Glucose 2 ml 7.5% NaHCO3 1.5 ml 1M HEPES 0.5 ml Transferrin, Putrescine solution 4 ml 25 mg insulin solution 4 ml Selenium 100 μl Progesterone 100 μl Hormone Mix (100 ml total, store at -20 °C) Item Volume Autoclaved water 37.5 ml 10X DMEM/F12 (3:1) 5 ml 30% Glucose 1 ml 7.5% NaHCO3 0.75 ml 1M HEPES 0.25 ml Hormone mix 5 ml L-glutamine 0.5 ml Penicillin-streptomycin 0.5 ml Serum Free Media EFH-SFM: add 10 μl of EGF, 10 μl of FGF, and 3.66 μl of Heparin FBS-SFM: add 0.5 ml FBS Item Volume Matrigel 150 μl SFM 3.6 ml Matrigel Solution Matrigel aliquot should be placed in a box of ice and allowed to thaw slowly over 4-5 hours to form a viscous liquid before mixing with SFM. This will ensure the formation of a smooth layer of Matrigel substrate. If not thawed slowly, the resulting substrate will contain clumps of Matrigel, possibly hindering cell migration. Item Volume or Mass UltraPure Agarose 300 mg in 10 ml ddH20 SFM Heat Inactivated FBS 8 ml 2 ml Matrigel Solution Mix 8 ml of SFM with 2 ml heat inactivated FBS in a 15 cc falcon tube. Mix agarose with 10 ml ddH20 in an Erlenmeyer flask, and heat in a microwave for 30 sec in 10-sec intervals, ensuring to remove the solution from the microwave after each 10-sec interval and thoroughly mix. Following the final 10-sec microwave period, mix the agarose solution with the SFM/FBS solution and store in a 57 °C water bath.