Ex Vivo Vurdering af kontraktilitet, udmattelse og Alternans i isoleret skeletmuskulatur

Summary

Vi beskriver en metode til direkte at måle muskel kraft, muskelkraft, kontraktile kinetik og udmattelse af isolerede skeletmuskulatur i et<em> In vitro</em> System ved hjælp af felt stimulation. Værdifuld information om Ca^{2 +} Håndteringsegenskaber og kontraktile maskiner af musklen kan opnås ved hjælp af forskellige stimulerende protokoller.

Abstract

Beskrevet her er en metode til måling kontraktilitet af isolerede skeletmuskulatur. Parametre som muskelkraft, muskel magt, kontraktile kinetik, udmattelse, og bedring efter træthed kan fås til at vurdere bestemte aspekter af excitation-kontraktion kobling (ECC) proces, såsom ophidselse, kontraktile maskiner og Ca ^{2 +} håndtering evne. Denne metode fjerner nerve og blodforsyning og fokuserer på det isolerede skeletmuskulatur selv. Vi rutinemæssigt bruger denne metode til at identificere genetiske komponenter, der ændrer den kontraktile egenskab af skeletmuskulatur selvom modulere Ca ^{2 +} signalveje. Her beskriver vi en nyligt identificeret skeletmuskel fænotype, dvs mekaniske alternans, som et eksempel på de forskellige og rige information, der kan opnås ved anvendelse af in vitro muskulatur assay. Kombination af denne analyse med enkelte celleassays, genetiske tilgange og biochemistry assays kan give vigtig indsigt i mekanismerne i ECC i skeletmuskulatur.

Introduction

Skeletmuskulatur tillægger knogler i skelettet og generere kontraktile kræfter under styring af det centrale nervesystem. Excitation-kontraktionskoblingen (ECC) henviser til processen med at konvertere en elektrisk stimulus til en mekanisk reaktion. Ca ^{2 +-signalering} er en vigtig bestanddel af den kontraktile funktion i skeletmuskulaturen. Effektiv ^{Ca2 +-mobilisering} fra sarkoplasmiske reticulum (SR) er en vigtig komponent for ECC i muskelceller ^{1, 2,} og ændringer i intracellulær Ca ^{2 +-signalering} ligger bag den tilsvarende kontraktile dysfunktion hos en række muskelsygdomme ^3-5. Korrekt vurdering af muskulatur er afgørende og gratis til ^{Ca2 +} billeddannelse og andre assays til at få indblik i skeletmuskel funktion og ikke kun på den kontraktile plan, men også på den kinetiske plan. Kraft og hastighed kan også opnås at informere vigtige egenskabmuskel magt og status for ECC-processen under forskellige fysiologiske og patofysiologiske forhold.

Denne frugtbare forskningsfelt har en meget rig historie og mange teorier om muskelsammentrækning dukkede mere end to årtusinder ^6. Moderne muskel forskning sandsynligvis begynder i 1674-1682 med den mikroskopiske observation af cross-riller og myofibriller i muskelfibrene ved Leeuwenhoek ^6. Næsten et århundrede senere, observerede Luigi Galvani, at frøen muskel kontrakter kraftigt, når dens nerve er rørt med skalpel under en gnist udledning fra en fjern elektrisk maskine ^7-9. Kontraktion kan også fremstilles ved at forbinde benet nerve til musklen via en metalleder. Detaljerne i den komplekse elektrisk signaludstyr mekanisme anbefalet i Galvani blev til sidst formuleret af Hodgkin, Huxley og Katz i deres berømte ligning ^{10, 11,} der blev grundlaget for elektrofysiologi. De bemærkelsesværdige observationer af Ringer om virkningerne af ekstracellulær Ca ^{2 +} om kontraktilitet af frøen hjerte-og skeletmuskulatur ^12-15 repræsenterer det første store skridt i anerkendelsen af Ca ^{2 +} som en vigtig regulator af muskel kontraktilitet ^{16, 17.} Fra 1980 har til i dag en byge af opdagelser i musklen kontraktilitet feltet blev realiseret som følge af indførelsen af muskel kontraktilitet og udmattelse protokoller i murine skeletmuskulatur ^18. Jones og Edwards var den første til at foreslå, at lavfrekvente intermitterende træthed (anstrengelsesudløst reduktion i kraft) ¹⁹ var forbundet med ændringer i ECC maskiner og ikke den kontraktile apparat. I slutningen af 1980 og begyndelsen af 1990 er blev Kolkeck m.fl. ^20, Kolbeck og Nosek ^21, og Reid ²² ved hjælp af mellemgulvet muskler fra gnavermodeller for at studere virkningerne af theophyllinere, cortiosterone, og frie radikaler på skeletmuskulaturen kontraktilitet, mens Brooks og Faulknis var de første til at rapportere om målinger af gentagne kraft og effektmålinger i hurtige-og langsomme-muskler fra mus ^22. Desuden var Lannegren, Westerblad, Lamb, og Westerblad den første til direkte linke ex vivo kontraktilitet med intracellulær Ca ^{2 +} regulering og begyndte at sætte spørgsmålstegn rolle acidose i muskel træthed ^{23, 24.}

Vores laboratorier har bidraget betydeligt siden begyndelsen af 2000 har til forståelse af hidtil ukendte gener med modulerende og regulatoriske roller på muskel ECC med kritiske roller i muskel kontraktilitet, udmattelse, og aldring ved hjælp af en kombination af intakte mus muskulatur undersøgelser, intracellulær Ca ^{2 +-overvågning} i intakte og flået muskelfibre og molekylær-genetiske manipulationer ^{3-5, 25-29.}

Her har vi detaljeret den eksperimentelle protokol til måling af kontraktilitet af murine isolerede soleus og extensor digitorum longus (EDL) muskler, som svarer til en hovedsagelig langsomt oxidativ (type I og IIa muskelfibre) og en hovedsagelig hurtigt glyocolytic muskel (type IIb og IIx muskelfibre) med forskellige kontraktile egenskaber. I denne protokol blev intakte muskel-sene komplekser isoleret og badet i en ADI PowerLab Radnotti kammer, der leveres med enten ren ilt eller en blanding af ilt (95%) og CO ₂ (5%). Kontraktile kræfter blev genereret af elektriske stimulationer fra en Grass stimulator og detekteret ved hjælp af en krafttransducer, der blev integreret med en ADI PowerLab/400 system, så tilpasning af makro rutiner til at styre erhvervelse, indsamling, digitalisering og opbevaring af data. Denne konfiguration kan måle muskelkraft, muskelkraft, og den kraft vs frekvensforhold, muskeltræthed, overvindelse af muskeltræthed, hastighed og samlede kinetiske egenskaber af muskelkontraktion. Desuden kan virkningerne af lægemidler på muskelsammentrækning overvåges gennem disse eksperimenter. </p>

Fordelene ved denne metode lå i fjernelse af de neuronale og vaskulære komponenter væk fra skeletmuskel, hvilket muliggør vurdering af de iboende egenskaber kontraherende muskel. Desuden tillader ex vivo kontraktilitet assays manipulation af det ekstracellulære miljø omkring de isolerede muskler, hvilket muliggør anvendelsen af farmakologiske manipulationer af forskellige ion permeationsforøgende kanaler og transportere for at definere deres fysiologiske roller for skeletalmuskelfunktion.

Denne ex vivo-system har givet os mulighed for nylig opdage en særskilt alternan adfærd i visse mutante muskel præparater, som er forbundet med ændret ^{intracellulære} Ca2 ⁺ håndteringsegenskaber ^4. Alternans defineres som svingende burst episoder af kontraktil kraft under tilbagegangen fase af trættende profil. Under disse begivenheder kontraktile kræfter momentant øges ud over det tidligere niveau af force dnder trættende stimulation, måske fordi enten mere Ca ^{2 +} bliver frigivet eller den kontraktile maskineri er blevet mere følsom over for Ca ^{2 + 30.} Behandling af cyclopiazonic acid (CPA), en reversibel blokering af sarkoplasmiske-endoplasmatiske reticulum calcium ATPase (SERCA), koffein, en agonist af ryanodine kanal (RyR) og gentagen trættende stimuleringer kan alle inducere mekaniske alternans ^4, tyder på, at alternans er direkte relateret til modulation af EF koblingen processen. Demonstration af fremgangsmåden til at inducere og optage mekaniske alternans i in vitro kontraktilitet opsætning fungerer som et eksempel for at vise de forskelligartede eksperimentelle parametre, der kan opnås med dette system eller lignende dem, baseret på individuelle forskningsinteresser.

Denne metode kan være af interesse for forskere studerer muskel fysiologi. Lignende opsætning kan også anvendes til isolerede skelet muscle-tendon/ligament komplekser fra andreanatomiske steder, såvel som for enkelte fibre og muskelstrimler.

Protocol

Opløsningen sammensætning: 2,5 mM Ca2 + Tyrode-opløsning: 140 mM NaCl, 5 mM KCI, 10 mM HEPES, 2,5 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 og 10 mM glucose 0 mM Ca2 + Tyrode-opløsning: 140 mM NaCl, 5 mM KCI, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 0,1 mM ethylenglycol-tetraeddikesyre (EGTA) og 10 mM glucose Bemærk: badopløsningen skal være mættet med 100% O2, hvis anvendelse af den ovennævnte oplø…

Discussion

Måling af kontraktile kraft og udmattelse er vigtig for den samlede vurdering af skeletmuskulatur funktion. Hovedformålet med denne analyse er at identificere forandringer i muskelkraft og trættende egenskaber under visse patologiske tilstande, såsom sarcopenia og muskeltræthed, og for at afprøve effekten af ​​narkotika / reagenser på muskel kontraktilitet. Eftersom muskelkraft er tæt forbundet med ^{intracellulære} Ca2 ⁺ release, ^{ekstracellulær} Ca2 ⁺ indgang og kry…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
2-APB	Tocris	1224	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and TRP etc.
SKF96365	Sigma	SKF-96365	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and receptor-mediated Ca2+ entry etc.
BTP-2	Millipore	203890-5MG	Relatively specific SOC blocker
CPA	Sigma	C1530	Reversible SERCA blocker
caffeine	Sigma	C0750	Fast action RyR agonist
Radnoti Four Unit Tissue Organ Bath System	Radnoti	159920
Combination Tissue Support/Stimulating Electrode	Radnoti	160151	Vertical Zig Zag Type with tissue support
Quad Bridge Amp	ADInstruments	FE224
PowerLab/400	ADInstruments		This product is no longer available. Choose other version of the data acquisition system.
Force Transducers (5 mg – 25 g)	ADInstruments	MLT0201/RAD
Chart v4.02	ADInstruments		LabChart 7.3 is the latest version of Chart software.
S8800 Dual Pulse Digital Stimulator	GRASS TECHNOLOGIES		This product is no longer available. S88X Dual Output Square Pulse Stimulator is a newer stimulator.
RF Transformer Isolation Unit	GRASS TECHNOLOGIES	Model SIU5