הערכת Vivo לשעבר של התכווצות, ועיפנות Alternans בשרירי שלד מבודדים

Summary

אנו מתארים שיטה ישירה למדידת כוח שרירים, כוח שרירים, התכווצות וקינטיקה עיפנות של שרירי שלד מבודדים ב<em> במבחנה</em> מערכת באמצעות גירוי תחום. מידע רב ערך על Ca^{2 +} מאפייני טיפול ומכונה התכווצות של השריר ניתן להשיג באמצעות פרוטוקולים שונים המגרים את הדמיון.

Abstract

מתואר כאן היא שיטה למדידת התכווצות של שרירי שלד מבודדים. פרמטרים כגון כוח שריר, כוח השריר, קינטיקה התכווצות, עיפנות, והתאוששות לאחר עייפות ניתן להשיג להעריך היבטים ספציפיים של צימוד עירור הכיווץ (ECC) תהליך כגון רגישות, מכונה התכווצות וCa ^{2 +} יכולת טיפול. שיטה זו מסירה את אספקת דם והעצבים ומתמקדת בשרירי השלד המבודדים עצמו. אנו משתמשים באופן שגרתי בשיטה זו כדי לזהות מרכיבים גנטיים המשנים את נכס ההתכווצות של שריר השלד למרות ויסות Ca ^{2 +} מסלולי איתות. כאן, אנו מתארים פנוטיפ זיהה לאחרונה שלד שריר, כלומר, alternans מכונאי, כדוגמה למידע המגוון ועשיר שניתן להשיג באמצעות בדיקה בהתכווצות שרירי מבחנה. שילוב של assay זה עם מבחנים בודדים סלולריים, גישות גנטיות וbiochemiמבחני stry יכולים לספק תובנה חשובות למנגנונים של ECC בשרירי שלד.

Introduction

שרירי שלד לצרף לעצמות השלד וליצור כוחות התכווצות תחת השליטה של ​​מערכת העצבים המרכזית. צימוד עירור-התכווצות (ECC) מתייחס לתהליך של המרת גירוי חשמלי לתגובה מכאנית. Ca ^{2 +} איתות היא מרכיב חיוני בתפקוד כויץ בשרירי שלד. יעיל Ca ^{2 +} גיוס מreticulum sarcoplasmic (SR) הוא מרכיב חשוב לECC בתאי שריר ^{1, 2,} ושינויים בCa ^{2 +} איתות התאי בבסיס תפקוד כויץ המקביל במספר מחל שרירים ^3-5. הערכה נכונה של התכווצות שרירים היא חיונית ומחמיא לCa ^{2 +} הדמיה ומבחנים אחרים כדי להשיג תובנה לתפקוד שרירי שלד, ולא רק ברמת כויץ, אלא גם ברמה קינטית. כוח ומהירות גם ניתן להשיג על מנת ליידע את התכונה החשובה שלכוח שרירים ומצב תהליך ECC בתנאים פיסיולוגיים וpathophysiological שונים.

תחום זה של מחקר פורה יש היסטוריה עשירה מאוד ותאוריות רבות של התכווצות שרירים, הופיעו מעל אלפיים שנה ^6. מחקר השרירים מודרני כנראה מתחיל ב1674-1682 באבחנה המיקרוסקופית של-קווקווים צולבים וmyofibrils בסיבי שריר על ידי ⁶ יוונהוק. כמעט מאה שנה מאוחר יותר, לואיג'י גלוואני הבחין כי תוקף חוזי שרירי צפרדע כשהעצב שלה הוא נגע עם אזמל במהלך פריקת ניצוץ ממכונה חשמלית רחוקה ^7-9. התכווצות יכולה גם להיות מיוצרת על ידי חיבור העצב לשריר הרגל דרך מוליך מתכתי. את הפרטים של מנגנון האיתות החשמלי המורכב הטיפו גלווני סופו של דבר גובשו על ידי הודג'קין, הקסלי וכץ במשוואה המפורסמת שלהם ^{10, 11,} שהפכה לבסיס של אלקטרו. התצפיות המדהימות של ריןגר על ההשפעות של תאי Ca ^{2 +} על ההתכווצות של לב צפרדע ושרירי שלד ^12-15 מייצג את הצעד הראשון החשוב בהכרה של Ca ^{2 +} כרגולטור מפתח של התכווצות שרירים ^{16, 17.} משינה 1980 ועד ימינו פרץ של תגליות בתחום התכווצות השרירים מומש עקב כניסתה של התכווצות שרירים ופרוטוקולי עיפנות בשרירי שלד Murine ^18. ג'ונס ואדוארדס היו הראשון שטענה כי עייפות לסירוגין בתדירות נמוכה (הפחתת פעילות גופנית הנגרמת בכוח) ¹⁹ היו קשורים לשינויים במכונות ECC ולא מנגנון ההתכווצות. בשנת 1980 מאוחר ו1990 המוקדמים, Kolkeck et ²⁰ אל, Kolbeck וNosek ^21, ו ²² ריד היו באמצעות שריר סרעפת ממכרסמים כדי לחקור את ההשפעות של theophyllines, cortiosterone, ורדיקלים חופשיים בהתכווצות שרירי שלד, ואילו ברוקס וFaulknאה היו ראשון לדווח על מדידות של כוח חזר ומדידות כוח ובפה מהר שרירים איטיים מעכברים ^22. בנוסף, Lannegren, Westerblad, כבש, וWesterblad היו הראשון ישירות לקשר contractility vivo לשעבר עם Ca ^{2 +} תאי רגולציה והתחיל לחקור את תפקידו של חמצת בעייפות שרירים ^{23, 24.}

המעבדות שלנו תרמו באופן משמעותי מאז 2000 מוקדמים לקראת הבנה של גני רומן עם עצב ותפקידים הרגולטוריים על השריר ECC עם תפקידים קריטיים בהתכווצות שרירים, עיפנות, והזדקנות באמצעות שילוב של מחקרי contractility שרירי עכבר שלמים, תאיים Ca ^{2 +} ניטור ב סיבי שריר שלם ועור ומניפולציות גנטיות מולקולרית ^{3-5, 25-29.}

כאן אנו מפורטים פרוטוקול הניסוי, למדידת התכווצות של soleus המבודד Murine וlongus digitorum פושטים (EDL) שרירים, אשר תואמים את רוב איטי חמצונים (אני סוג וסיבי שריר IIa) ובעיקר שרירים מהירים glyocolytic (הסוג IIb וסיבי שריר IIx) עם תכונות התכווצות מובחנות. בפרוטוקול זה, קומפלקסים שלמים שריר גיד היינו מבודדים ורחצו במערכת ADI PowerLab Radnotti קאמרית מסופקת גם עם חמצן טהור או בתערובת של חמצן (95%) ו-CO ₂ (5%). כוחות התכווצות נוצרו על ידי גירויים חשמליים מממריץ גראס וזוהה באמצעות מתמר כוח שהיה משולב עם מערכת PowerLab/400 ADI, המאפשר התאמה אישית של שגרת מאקרו לשלוט רכישה, האיסוף, דיגיטציה, והאחסון של נתונים. התקנה זו יכולה למדוד כוח שרירים, כוח שרירים, כמו גם את יחסי כוח מול תדר, עייפות שרירים, התאוששות מעייפות שרירים, מהירות ותכונות הקינטית כוללות של התכווצות שרירים. בנוסף, השפעות של תרופות על התכווצות שרירים ניתן לנטר באמצעות ניסויים אלה. </p>

יתרונות של שיטה זו טמונות בהסרת רכיבים העצביים וכלי דם משריר השלד, המאפשרים הערכה ישירה של המאפיינים הפנימיים של הידבקות שרירים. בנוסף, מבחני contractility vivo לשעבר לאפשר מניפולציה של הסביבה התאית המקיפה את השרירים המבודדים, המאפשרת שימוש במניפולציות פרמקולוגיים של ערוצים שונים יון חלחול ומובילים במטרה להגדיר את תפקידיהם הפיסיולוגיים לתפקוד שרירי שלד.

מערכת vivo לשעבר זה אפשרה לנו לאחרונה מגלה התנהגות מובהקת alternan בהכנות שרירי מוטציה מסוימות, שהיו קשורים לCa שינה התאי ^{2 +} טיפול נכסים ^4. Alternans מוגדרים כפרקי פרץ תנודות של כוח התכווצות בשלב הירידה של הפרופיל עייף אותו. במהלך אירועים אלה כוחות התכווצות רגע להגדיל מעל רמתו הקודמת בכוח דuring גירוי מתיש, אולי כי גם יותר Ca ^{2 +} מתפרסם או מכונות כויץ הפכו רגישות יותר לCa ^{2 + 30.} טיפול בחומצת cyclopiazonic (רו"ח), חוסם הפיך של סידן reticulum ATPase sarcoplasmic-endoplasmic (SERCA), קפאין, אגוניסט של ryanodine ערוץ (RyR) וחזרתי לעייף גירויים יכול לגרום לכל alternans המכאני ^4, מה שמראה כי alternans קשור ישירות אפנון של תהליך צימוד EC. הדגמה של השיטה כדי לגרום ולהקליט alternans מכונאי בהתקנת contractility מבחנה משמשת כדוגמה כדי להראות את הפרמטרים הניסיוניים המגוונים שיכול להיות שהושגו עם מערכת זו או דומים לאלה, המבוסס על תחומי מחקר בודדים.

שיטה זו עשויה להיות עניין לחוקרים הלומדים פיזיולוגיה של שרירים. התקנה דומה יכולה לשמש גם למתחמי muscle-tendon/ligament שלד מבודדים משנימקומות אנטומיים, כמו גם לסיבים בודדים ורצועות שרירים.

Protocol

הרכב פתרון: 2.5 מ"מ Ca 2 + פתרון Tyrode: 140 המ"מ NaCl, 5 המ"מ KCl, 10 HEPES מ"מ, 2.5 מ"מ CaCl 2, 2 מ"מ MgCl 2 וגלוקוז 10 מ"מימ 0 מ"מ Ca 2 + פתרון Tyrode: 140 המ"מ NaCl, 5 המ"מ KCl, 10 HEPES מ"מ, 2…

Discussion

המדידה של כוח ועיפנות כויץ חשובה להערכה הכוללת של תפקוד שרירי שלד. המטרה העיקרית של בדיקה זו היא לזהות שינויים בכוח השרירים ומאפיינים מעייפים תחת מצבים פתולוגיים מסוימים, כגון sarcopenia ועייפות שרירים, ולבדוק את ההשפעה של תרופות / ריאגנטים על התכווצות שרירים. מאז כוח השר…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
2-APB	Tocris	1224	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and TRP etc.
SKF96365	Sigma	SKF-96365	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and receptor-mediated Ca2+ entry etc.
BTP-2	Millipore	203890-5MG	Relatively specific SOC blocker
CPA	Sigma	C1530	Reversible SERCA blocker
caffeine	Sigma	C0750	Fast action RyR agonist
Radnoti Four Unit Tissue Organ Bath System	Radnoti	159920
Combination Tissue Support/Stimulating Electrode	Radnoti	160151	Vertical Zig Zag Type with tissue support
Quad Bridge Amp	ADInstruments	FE224
PowerLab/400	ADInstruments		This product is no longer available. Choose other version of the data acquisition system.
Force Transducers (5 mg – 25 g)	ADInstruments	MLT0201/RAD
Chart v4.02	ADInstruments		LabChart 7.3 is the latest version of Chart software.
S8800 Dual Pulse Digital Stimulator	GRASS TECHNOLOGIES		This product is no longer available. S88X Dual Output Square Pulse Stimulator is a newer stimulator.
RF Transformer Isolation Unit	GRASS TECHNOLOGIES	Model SIU5