Vivo Valutazione Ex della contrattilità, affaticabilità e alternanza in isolati muscoli scheletrici

Summary

Descriviamo un metodo per misurare direttamente la forza muscolare, potenza muscolare, cinetica contrattili e affaticabilità dei muscoli scheletrici isolati in un<em> In vitro</em> Sistema tramite stimolazione del campo. Informazioni preziose su Ca^{2 +} Proprietà di manipolazione e macchinari contrattile del muscolo può essere ottenuta utilizzando diversi protocolli stimolanti.

Abstract

Qui descritto è un metodo per misurare la contrattilità dei muscoli scheletrici isolati. Parametri come forza muscolare, potenza muscolare, cinetica contrattili, affaticabilità, e il recupero dopo la fatica può essere ottenuta per valutare aspetti specifici della eccitazione-contrazione (ECC) di processo quali eccitabilità, contrattilità macchinari e Ca ^{2 +} capacità di movimentazione. Questo metodo elimina la fornitura nervoso e sangue e si concentra sul muscolo scheletrico isolato stessa. Abbiamo regolarmente usare questo metodo per identificare i componenti genetiche che alterano la proprietà contrattile del muscolo scheletrico se modulanti Ca ^{2 +} vie di segnalazione. Qui, descriviamo un fenotipo appena identificato muscolo scheletrico, cioè, alternans meccanico, come esempio di varie informazioni e ricco che può essere ottenuto usando la prova in vitro contrattilità muscolare. La combinazione di questo test con saggi su cellule singole, approcci genetiche e biochimichesaggi Stry in grado di fornire importanti informazioni sui meccanismi di ECC nei muscoli scheletrici.

Introduction

Muscoli scheletrici allegare ossa dello scheletro e generano forze contrattili sotto il controllo del sistema nervoso centrale. Eccitazione-contrazione (ECC) si riferisce al processo di conversione di uno stimolo elettrico ad una risposta meccanica. Ca ^{2 +} segnalazione è un componente essenziale della funzione contrattile nel muscolo scheletrico. Efficace Ca ^{2 +} mobilitazione dal reticolo sarcoplasmatico (SR) è un componente importante di ECC in cellule muscolari ^{1, 2,} e cambiamenti intracellulare Ca ^{2 +} segnalazione alla base della disfunzione contrattile corrispondente in una serie di malattie muscolari ^3-5. Corretta valutazione della contrattilità muscolare è essenziale e gratuito per Ca ^{2 +} imaging e altri test per acquisire conoscenze in funzione dei muscoli scheletrici, non solo a livello contrattile, ma anche a livello cinetico. Forza e velocità possono anche essere ottenuti per informare l'importante proprietà dimuscolo potenza e lo stato del processo ECC in diverse condizioni fisiologiche e fisiopatologiche.

Questo campo fecondo di ricerca ha una storia molto ricca e molte teorie di contrazione muscolare è apparso più di due millenni ^6. Di ricerca del muscolo moderna comincia probabilmente in 1674-1682 con l'osservazione microscopica di cross-striature e le miofibrille nelle fibre muscolari di Leeuwenhoek ^6. Quasi un secolo dopo, Luigi Galvani ha osservato che muscolo si contrae rana vigorosamente quando il suo nervo è toccato con bisturi durante una scarica di scintille da una macchina elettrica distante ^7-9. Contrazione potrebbe anche essere prodotto collegando il nervo gamba al muscolo attraverso un conduttore metallico. I dettagli del complesso meccanismo di segnalazione elettrica sostenuti da Galvani finalmente sono stati formulati da Hodgkin, Huxley e Katz nella loro famosa equazione ^{10, 11} che divenne il fondamento di elettrofisiologia. Le osservazioni notevoli di Ringer sugli effetti di Ca ^{2 +} extracellulare sulla contrattilità del cuore rana e nei muscoli scheletrici ^12-15 rappresentano il primo passo importante nel riconoscimento di Ca ^{2 +} come un regolatore chiave della contrattilità muscolare ^{16, 17.} Dal 1980 ad oggi una raffica di scoperte nel campo contrattilità muscolare è stato realizzato a causa dell'introduzione della contrattilità muscolare e affaticabilità protocolli in murine muscoli scheletrici ^18. Jones e Edwards sono stati i primi a suggerire che la fatica a bassa frequenza intermittente (indotta da esercizio fisico riduzione della forza) ¹⁹ è stato associato con modifiche ai macchinari ECC e non l'apparato contrattile. Alla fine del 1980 e all'inizio del 1990, Kolkeck et al ^20, Kolbeck e Nosek ^21, e Reid ²² sono stati utilizzando muscolo diaframma da modelli di roditori per studiare gli effetti della teofillina, cortiosterone, e dei radicali liberi sulla contrattilità del muscolo scheletrico, mentre Brooks e Faulkner sono stati i primi a riferire sulle misure di forza ripetute e misure di potenza in rapida-e-lenti i muscoli di topi ^22. Inoltre, Lannegren, Westerblad, Agnello, e Westerblad stati i primi a collegare direttamente la contrattilità ex vivo con intracellulare di Ca ^{2 +} regolamento e ha iniziato a mettere in discussione il ruolo di acidosi nella fatica muscolare ^{23, 24.}

I nostri laboratori hanno contribuito in modo significativo fin dai primi anni del 2000 verso la comprensione di nuovi geni con modulante e ruoli di regolamentazione sul muscolo ECC con ruoli critici nella contrattilità muscolare, affaticabilità, e l'invecchiamento utilizzando una combinazione di studi intatti topo muscolari contrattilità, intracellulare Ca ² monitoraggio ⁺ in fibre muscolari intatte e dalla pelle e genetico-molecolari manipolazioni ^{3-5, 25-29.}

Qui dettagliato protocollo di sperimentazione per la misurazione della contrattilità murini soleo isolate e estensore lungo delle dita (EDL muscoli), che corrispondono ad una prevalentemente lenta ossidativo (tipo I e fibre muscolari IIa) e un muscolo prevalentemente fast-glyocolytic (tipo IIb e fibre muscolari IIx) con spiccate proprietà contrattili. In questo protocollo, intatte muscolotendinee complessi sono stati isolati e immersi in un sistema PowerLab ADI Radnotti camera fornito sia con ossigeno puro o una miscela di ossigeno (95%) e CO ₂ (5%). Forze contrattili sono stati generati da stimoli elettrici da uno stimolatore Erba e rilevato utilizzando un trasduttore di forza che è stato integrato con un sistema ADI PowerLab/400, consentendo la personalizzazione delle routine macro per controllare l'acquisizione, la raccolta, digitalizzazione e archiviazione dei dati. Questa configurazione può misurare la forza muscolare, potenza muscolare, nonché il rapporto di forza rispetto a frequenza, affaticamento muscolare, recupero da affaticamento muscolare, velocità e complessivi proprietà cinetiche di contrazione muscolare. Inoltre, gli effetti dei farmaci sulla contrazione muscolare può essere monitorata attraverso questi esperimenti. </p>

I vantaggi di questo metodo consistevano nel rimuovere i componenti neuronali e vascolari dal muscolo scheletrico, consentendo la valutazione diretta delle proprietà intrinseche di contrazione muscolare. Inoltre, saggi contrattilità ex vivo consentire la manipolazione del mezzo extracellulare che circonda i muscoli isolati, che consente l'uso di manipolazioni farmacologiche dei vari canali ionici permeazione e trasportatori per definire i loro ruoli fisiologici per la funzione del muscolo scheletrico.

Questo sistema ex vivo ci ha permesso di scoprire recentemente un comportamento distinto alternan in taluni preparati muscolari mutanti, che erano legate ad una alterata intracellulare di Ca ^{2 +} la gestione delle proprietà ^4. Alternanza sono definiti come episodi scoppio fluttuanti di forza contrattile durante la fase di declino del profilo faticosa. Durante questi eventi forze contrattili momentaneamente aumentare di sopra del suo livello precedente di forza durante la stimolazione faticoso, forse perché più o Ca ^{2 +} è stato rilasciato o la macchina contrattile è diventato più sensibile alle Ca ^{2 + 30.} Trattamento con acido ciclopiazonico (CPA), un bloccante reversibile-sarcoplasmatico reticolo endoplasmatico calcio ATPasi (SERCA), caffeina, un agonista del canale rianodina (RyR) e faticoso stimolazioni ripetute possono indurre alternans meccaniche ^4, suggerendo che alternans sono direttamente collegate modulazione del processo di accoppiamento CE. Dimostrazione del metodo per indurre e registrare in alternanza meccanici in configurazione contrattilità in vitro serve come esempio per mostrare i parametri diversificati sperimentali che potrebbero essere ottenuti con questo sistema o simili, sulla base di interessi di ricerca individuali.

Questo metodo può essere di interesse per i ricercatori che studiano la fisiologia muscolare. Configurazione simile può essere utilizzato anche per isolati complessi muscle-tendon/ligament scheletrici di altrisedi anatomiche, nonché per singole fibre muscolari e strisce.

Protocol

Soluzione composizione: 2,5 mM Ca 2 + soluzione di Tyrode: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2,5 mM CaCl 2, 2 mM MgCl2 e 10 mM di glucosio 0 mM Ca 2 + Tyrode soluzione: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 0,1 mM di etilene glicole acido tetraacetico (EGTA) e 10 mM di glucosio Nota: soluzione balneazione deve essere saturato con 100% O 2 se si utilizza la soluzione di cu…

Discussion

Misurazione della forza contrattile e affaticabilità è importante per la valutazione complessiva della funzione muscolare scheletrico. Lo scopo principale di questo test è quello di identificare i cambiamenti nella forza muscolare e le proprietà affaticanti in determinate condizioni patologiche, come sarcopenia e l'affaticamento muscolare, e per testare l'effetto dei farmaci / reagenti sulla contrattilità muscolare. Dal momento che la forza muscolare è strettamente correlato con intracellulare Ca ^{2 + …}

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
2-APB	Tocris	1224	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and TRP etc.
SKF96365	Sigma	SKF-96365	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and receptor-mediated Ca2+ entry etc.
BTP-2	Millipore	203890-5MG	Relatively specific SOC blocker
CPA	Sigma	C1530	Reversible SERCA blocker
caffeine	Sigma	C0750	Fast action RyR agonist
Radnoti Four Unit Tissue Organ Bath System	Radnoti	159920
Combination Tissue Support/Stimulating Electrode	Radnoti	160151	Vertical Zig Zag Type with tissue support
Quad Bridge Amp	ADInstruments	FE224
PowerLab/400	ADInstruments		This product is no longer available. Choose other version of the data acquisition system.
Force Transducers (5 mg – 25 g)	ADInstruments	MLT0201/RAD
Chart v4.02	ADInstruments		LabChart 7.3 is the latest version of Chart software.
S8800 Dual Pulse Digital Stimulator	GRASS TECHNOLOGIES		This product is no longer available. S88X Dual Output Square Pulse Stimulator is a newer stimulator.
RF Transformer Isolation Unit	GRASS TECHNOLOGIES	Model SIU5