Ex vivo Bedömning av kontraktilitet, fatigability och Alternans i isolerade skelettmuskler

Summary

Vi beskriver en metod för att direkt mäta muskler kraft, muskelkraft, sammandragande kinetik och fatigability isolerade skelettmuskler i<em> In vitro</em> System med fältstimulering. Värdefull information om Ca^{2 +} Hantera egenskaper och kontraktila maskiner av muskeln kan erhållas med olika stimulerande protokoll.

Abstract

Beskrivs här är en metod för att mäta kontraktilitet av isolerade skelettmuskler. Parametrar som muskel kraft, muskelkraft, sammandragande kinetik, fatigability och återhämtning efter utmattning kan erhållas för att bedöma vissa aspekter av excitation-kontraktion koppling (ECC) process som retbarhet, kontraktila maskiner och Ca ^{2 +} hantering förmåga. Denna metod tar bort nerven och blodtillförseln och fokuserar på den isolerade skelettmuskulaturen själv. Vi använder rutinmässigt den här metoden för att identifiera genetiska komponenter som förändrar kontraktila egendom skelettmuskel men modulera Ca ^{2 +} signalvägar. Här beskriver vi en nyligen identifierad skelettmuskulatur fenotyp, dvs mekaniker alternans, som ett exempel på de olika och rika information som kan erhållas med användning av in vitro-muskeln kontraktilitet analys. Kombination av denna analys med encelliga analyser, genetiska metoder och BiochemiStry analyser kan ge viktiga insikter i de mekanismer som ECC i skelettmuskulaturen.

Introduction

Skelettmuskulatur fäster ben i skelettet och generera kontraktila krafter under kontroll av det centrala nervsystemet. Excitering-Sammandragning koppling (ECC) avser processen att omvandla en elektrisk stimulus till en mekanisk respons. Ca ^{2 +-signalering} är en viktig del av den kontraktila funktion i skelettmuskulaturen. Effektiv Ca ^{2 +} mobilisering från sarkoplasmatiska retiklet (SR) är en viktig komponent för ECC i muskelcellerna ^{1, 2,} och förändringar i intracellulär Ca ^{2 +-signalering} ligger till grund för motsvarande kontraktil dysfunktion i ett antal muskelsjukdomar ^3-5. Korrekt bedömning av muskel kontraktilitet är nödvändig och gratis Ca ^{2 +} bildbehandling och andra analyser för att få inblick i skelettmuskulaturen funktion, inte bara på kontraktila nivå, men också på den kinetiska nivå. Kraft och hastighet kan även erhållas att informera den viktiga egenskapen avmuskelkraft och status för ECC-processen under olika fysiologiska och patofysiologiska förhållanden.

Denna fruktbara forskningsfält har en mycket rik historia och många teorier om muskelkontraktion dök över två årtusenden ^6. Modern muskel forskning börjar troligen 1674-1682 med mikroskopisk observation av tvärgående strimmor och myofibriller i muskelfibrer av Leeuwenhoek ^6. Nästan ett sekel senare, observerade Luigi Galvani som groda muskel kontrakt kraftfullt när dess nerv berörs med skalpell under en gnisturladdning från en avlägsen elektrisk maskin ^7-9. Sammandragning kan också produceras genom att ansluta benet nerven till muskeln via en metalledare. Detaljerna i den komplexa elektriska signalering mekanism som förespråkas av Galvani så småningom formulerades av Hodgkins, Huxley och Katz i sin berömda ekvation ^{10, 11} som blev grunden för elektrofysiologi. De anmärkningsvärda observationer av RinGer om effekterna av extracellulärt Ca ^{2 +} på kontraktilitet av groda hjärtat och skelettmuskulaturen ^12-15 representerar det första stora steget i erkännandet av Ca ^{2 +} som en viktig regulator av muskel kontraktilitet ^{16, 17.} Från 1980-talet fram till i dag en skur av upptäckter i muskeln kontraktilitet fältet genomfördes på grund av införandet av muskel kontraktilitet och protokoll fatigability i murina skelettmuskler ^18. Jones och Edwards var de första att föreslå att lågfrekventa intermittent trötthet (ansträngningsutlöst minskning gällande) ¹⁹ var associerad med förändringar i ECC maskiner och inte kontraktila apparaten. I slutet av 1980-talet och början av 1990-talet, var Kolkeck m.fl. ^20, Kolbeck och Nosek ^21, och Reid ²² med diafragman från gnagarmodeller för att studera effekterna av teofylliner, cortiosterone, och fria radikaler på skelettmuskulaturen kontraktilitet, medan Brooks och FaulknER var de första att rapportera om mätningar av upprepad kraft och mätningar makt i snabbt och långsamt muskler från möss ^22. Dessutom var Lannegren, Westerblad, lamm och Westerblad den första att direkt koppla ex vivo kontraktilitet med intracellulär Ca ^{2 +} reglering och började ifrågasätta roll acidos i muskeltrötthet ^{23, 24.}

Våra laboratorier har bidragit avsevärt sedan början av 2000-talet till förståelse av nya gener med modulerande och regulatoriska roller på muskel ECC med kritiska roller i muskel kontraktilitet, fatigability och åldrande genom att använda en kombination av intakta kontraktilitet mus muskel studier intracellulär Ca ^{2 +} övervakning intakta och flådda muskelfibrer och molekylär-genetiska manipulationer ^{3-5, 25-29.}

Här har vi närmare det experimentella protokollet för mätning kontraktilitet av murina isolerade soleus och extensor digitorum longus (EDL) muskler, som motsvarar en mestadels långsamt oxidativ (typ I och IIa muskelfibrer) och en mestadels snabbt glyocolytic muskel (typ IIb och IIx muskelfibrer) med distinkta kontraktila egenskaper. I detta protokoll var intakta muskel-senor komplex isoleras och badade i ADI PowerLab Radnotti kammarsystem levereras med antingen rent syre eller en blandning av syre (95%) och CO ₂ (5%). Kontraktila krafter genererades av elektriska stimuleringar från en Grass stimulator och detekteras med hjälp av en kraftgivare som integrerades med ADI PowerLab/400-system, vilket gör att anpassning av makro rutiner för att kontrollera förvärv, insamling, digitalisering och lagring av data. Denna setup kan mäta muskel kraft, muskelkraft, liksom kraften mot frekvensen relation, muskeltrötthet, återhämtning från muskeltrötthet, hastighet och övergripande kinetiska egenskaper muskelkontraktion. Dessutom kan effekterna av läkemedel på muskelkontraktion övervakas genom dessa experiment. </p>

Fördelarna med denna metod låg i att ta bort neuronala och vaskulära komponenter från skelettmuskulaturen, vilket direkt bedömning av inneboende egenskaper hos de upphandlande muskler. Dessutom ex vivo kontraktilitet analyser tillåter manipulering av den extracellulära miljön kring de isolerade muskler, vilket möjliggör användning av farmakologiska manipulationer av olika jonkanaler genomträngning och transportörer för att fastställa deras fysiologiska roll för skelettmuskulatur funktion.

Denna ex vivo system har tillåtit oss att nyligen upptäcka en distinkt alternan beteende i vissa muterade muskler preparat, som var knutna till förändrad intracellulär Ca ^{2 +} hantering egenskaper ^4. Alternans definieras som fluktuerande burst episoder av kontraktil kraft under nedgången fasen av tröttande profilen. Under dessa händelser kontraktila krafter ökar tillfälligt över den tidigare nivån av kraft dnder tröttande stimulering, kanske för att antingen mer Ca ^{2 +} släpps eller kontraktila maskiner har blivit mer känsliga för ^{Ca2 + 30.} Behandling av cyclopiazonic syra (CPA), en reversibel blockerare av sarkoplasmatiskt-endoplasmatiskt retikulum kalcium ATPas (SERCA), koffein, en agonist till ryanodine kanal (Ryr) och upprepade tröttande stimuli kan alla inducera mekaniska alternans ^4, vilket tyder på att alternans är direkt relaterade till modulering av EG kopplingsprocessen. Demonstration av metoden för att inducera och spela mekaniker alternans i in vitro kontraktilitet inställning fungerar som ett exempel för att visa de diversifierade experimentella parametrar som kan uppnås med detta system eller liknande sådana, baserat på individuella forskningsintressen.

Denna metod kan vara av intresse för forskare som studerar muskelfysiologi. Liknande inställning kan också användas för isolerade skelett muscle-tendon/ligament komplex från andraanatomiska platser, liksom för enskilda fibrer och band muskler.

Protocol

Lösning sammansättning: 2,5 mM Ca 2 + Tyrode-lösning: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2,5 mM CaClz 2, 2 mM MgCl2 och 10 mM glukos 0 mM Ca 2 + Tyrode-lösning: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 0,1 mM etylenglykol tetraättiksyra (EGTA) och 10 mM glukos Obs: badlösning bör vara mättad med 100% O 2 om användning av ovanstående lösning, men med 95% O 2</s…

Discussion

Mätning av kontraktila kraft och fatigability är viktigt för den övergripande utvärderingen av skelettmuskulaturen funktion. Det huvudsakliga syftet med denna analys är att identifiera förändringar i muskel kraft och tröttande fastigheter under vissa patologiska tillstånd, såsom sarcopeni och muskeltrötthet och att testa effekten av läkemedel / reagenser på muskel kontraktilitet. Eftersom muskeln kraften är nära besläktad med intracellulär Ca ^{2 +} release, extracellulärt Ca ^{2 +} in…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
2-APB	Tocris	1224	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and TRP etc.
SKF96365	Sigma	SKF-96365	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and receptor-mediated Ca2+ entry etc.
BTP-2	Millipore	203890-5MG	Relatively specific SOC blocker
CPA	Sigma	C1530	Reversible SERCA blocker
caffeine	Sigma	C0750	Fast action RyR agonist
Radnoti Four Unit Tissue Organ Bath System	Radnoti	159920
Combination Tissue Support/Stimulating Electrode	Radnoti	160151	Vertical Zig Zag Type with tissue support
Quad Bridge Amp	ADInstruments	FE224
PowerLab/400	ADInstruments		This product is no longer available. Choose other version of the data acquisition system.
Force Transducers (5 mg – 25 g)	ADInstruments	MLT0201/RAD
Chart v4.02	ADInstruments		LabChart 7.3 is the latest version of Chart software.
S8800 Dual Pulse Digital Stimulator	GRASS TECHNOLOGIES		This product is no longer available. S88X Dual Output Square Pulse Stimulator is a newer stimulator.
RF Transformer Isolation Unit	GRASS TECHNOLOGIES	Model SIU5