İzole İskelet Kaslar Kasılma, çabuk yorulma ve Alternans Ex Vivo Değerlendirilmesi

Summary

Biz doğrudan kas kuvveti, kas gücü, kasılma kinetiği ve izole iskelet kaslarında yorulma ölçmek için bir yöntem tarif<em> In vitro</em> Alan stimülasyonu kullanarak sistem. Ca değerli bilgiler^{2 +} Işlenme özelliklerini ve kas kasılma makine farklı uyarıcı protokolleri kullanarak elde edilebilir.

Abstract

Burada tanımlanan izole edilmiş iskelet kaslarının kasılmasına ölçmek için bir yöntemdir. Bu tür kas kuvveti, kas gücü, kasılma kinetiği, bitkinlik ve yorgunluk sonrası toparlanma gibi parametreler gibi heyecanlanma gibi eksitasyon-kasılma kenet belirli yönlerini (ECC) süreci, kontraktil makine ve Ca ^{2 +} taşıma yeteneğini değerlendirmek için elde edilebilir. Bu yöntem, sinir ve kan akımı kaldırır ve izole iskelet kası odaklanır. Biz rutin modüle Ca ^{2 +} sinyal yolları olsa iskelet kası kasılma özelliğini değiştiren genetik bileşenleri tanımlamak için bu yöntemi kullanın. Burada, in vitro kas kasılması tayininde kullanılarak elde edilebilir çok çeşitli ve zengin bir bilgi örneği olarak yeni tanımlanan bir iskelet kas fenotip, yani mekanik alternansı, tarif. Tek hücre deneyleri, genetik yaklaşımlar ve biyokimyasal ile bu tahlil kombinasyonustry deneyler iskelet kasındaki ECC mekanizmaları konularında önemli ipuçları sağlayabilir.

Introduction

Iskelet kasları, merkezi sinir sisteminin kontrolü altında kontraktil güçler iskelet kemik yapışır ve üretir. Eksitasyon-kasılma kenet (ECC), mekanik bir yanıt için bir elektrik uyaran dönüştürme sürecini ifade eder. Ca ^{2 +} sinyalizasyon iskelet kaslarında kasılma fonksiyonu önemli bir bileşenidir. Etkili Ca ² sarkoplazmik retikulum (SR) ^{+ 'dan} harekete önemli bir kas ^{hücresi, 1, 2} içinde ECC bileşen, ve hücre içi ^{Ca2 +} sinyali değişiklikler kas hastalıklarında ^3-5 arasında bir sayı karşılık gelen kontraktil fonksiyon bozukluğu altında yatan olup. Kas kasılması Uygun değerlendirme ⁺ görüntüleme ve diğer testler sadece kasılma düzeyinde, iskelet kası fonksiyonu içgörü kazanmak değil, aynı zamanda kinetik düzeyde önemlidir ve Ca ² ücretsizdir. Kuvvet ve hızı da önemli tesise bildirmeleri elde edilebilirfarklı fizyolojik ve patofizyolojik durumlardaki kas gücü ve ECC işleminin durumunu.

Bu araştırma bereketli alanında çok zengin bir tarihe sahiptir ve kas kasılması birçok teoriler iki bin üzerinde ⁶ çıktı. Modern kas araştırma muhtemelen Leeuwenhoek tarafından ⁶ kas liflerinin çapraz çizgiler ve miyofibril mikroskobik gözlem ile 1674-1682 yılında başlar. Onun sinir uzak bir elektrikli makine ^7-9 bir kıvılcım deşarj sırasında bistüri ile dokunulduğunda Neredeyse bir yüzyıl sonra, Luigi Galvani kurbağa kas sözleşmeleri şiddetle görülmektedir. Daralma ayrıca bir metal iletken ile kas için bacak sinirin bağlanması ile elde edilebilir. Galvani tarafından savunulan karmaşık elektriksel sinyal mekanizmasının ayrıntıları sonunda elektrofizyoloji temeli oldu onların ünlü denklemi ^{10, 11} Hodgkin, Huxley ve Katz tarafından formüle edildi. Rin çarpıcı gözlemlerger ⁺ kurbağa kalp ve iskelet kaslarının ^12-15 kasılma ekstraselüler Ca ² etkileri Ca ² tanınmasında ilk önemli adım ⁺ kas kontraktilite ^{16, 17} önemli bir düzenleyici olarak temsil eder. 1980'lerden günümüze kadar kas kasılması alanında keşifler bir patlama nedeniyle kas kontraktilite ve murin iskelet kaslarında ¹⁸ yorulma protokollerin tanıtımı gerçekleştirildi. Jones ve Edwards ¹⁹ ECC makine değişiklikleri değil, kontraktil aparat ile ilişkili olduğu düşük frekanslı aralıklı yorgunluk (kuvvet egzersizle oluşan azalma) önermek için ilk idi. Ise geç 1980 ve erken 1990 yılında, Kolkeck ark ^20, Kolbeck ve NOSEK ^21, ve Reid ^22, iskelet kası kasılma theophyllines, cortiosterone ve serbest radikallerin etkilerini incelemek için kemirgen modelleri diyafram kası kullandığınız Brooks ve Faulkner fareler ²² hızlı ve yavaş kasları tekrar kuvvet ve güç ölçümleri ölçümleri rapor için ilk idi. Buna ek olarak, Lannegren, Westerblad, Kuzu ve Westerblad doğrudan hücre içi Ca ^{2 +} yönetmeliğe ex vivo kontraktilite bağlamak için ilk ve kas yorgunluğu ^{23, 24} asidoz rolünü sorgulamaya başladı.

Bizim laboratuvarlar önemli ölçüde bozulmamış fare kas kontraktilite çalışmaları bir arada kullanarak erken 2000 en yeni genlerin anlayış yönelik düzenleyici ve düzenleyici rolleri ile kas ECC ilgili kas kasılması, bitkinlik, ve yaşlanma kritik rolleri beri katkıda, hücre içi Ca ^{2 +} izleme oylandı bozulmamış ve derili kas lifleri ve moleküler-genetik manipülasyonlar ^{3-5, 25-29.}

Burada fare izole soleus ve ekstansör digitorum longus ölçme kontraktilite (ED için deney protokolünde ayrıntılıKarşılık L) kasları çoğunlukla yavaş oksidatif (tip I ve IIa kas lifleri) ve farklı kontraktil özelliklere sahip bir çoğunlukla fast-glyocolytic kas (tip IIb ve IIx kas lifleri). Bu protokol, dokunulmamış kas-tendon kompleksleri izole edilmiş ve saf oksijen veya oksijen karışımı (% 95) ve _CO2 (% 5) ile birlikte bir ya da ADI PowerLab Radnotti hücre sistemi ile yıkanır. Kasılma güçleri Çim stimülatörü elektrik stimülasyonu ile oluşturulan ve makro rutinleri özelleştirme veri toplama, koleksiyon, dijitalleşme ve depolama kontrol etmeye izin veren, bir ADI PowerLab/400 sistemi ile entegre bir kuvvet dönüştürücü kullanılarak tespit edildi. Bu kurulum kas kuvveti, kas gücü, hem de kuvvet karşısında frekans ilişkileri, kas yorgunluğu, kas yorgunluğu, hız ve kas kasılması genel olarak kinetik özelliklerine iyileşme ölçebilir. Buna ek olarak, kas kasılması üzerinde ilaçların etkilerini bu deney ile takip edilebilir. </p>

Bu yöntemin avantajları kas sözleşme içsel özelliklerinin doğrudan değerlendirmesine imkân, iskelet kası uzak nöronal ve vasküler bileşenleri çıkarmadan yatıyordu. Buna ek olarak, ex vivo kontraktilite testleri çeşitli iyon nüfuz kanalları ve nakliyecilerin farmakolojik manipülasyonlar iskelet kas fonksiyonu için onların fizyolojik rolleri tanımlamak amacıyla kullanılmasını da sağlar izole kas çevreleyen ekstraselüler ortamın, manipülasyonu sağlar.

Bu ex vivo sistem bize son zamanlarda değiştirilmiş hücre içi Ca ² ile bağlantılı olan bazı mutant kas preparatlarında ayrı alternan davranış, ⁺ özellikleri ⁴ işleme keşfetmek için izin verdi. Alternans yorucu profilin azalma aşaması esnasında kasılma kuvveti değişen seri bölüm olarak tanımlanır. Bu olaylar sırasında kasılma kuvvetlerinin anlık kuvvet d önceki seviyenin üzerinde artışDaha fazla Ca ^{2 +} piyasaya sürülüyor veya kontraktil makine Ca ^{2 + 30} daha duyarlı hale gelmiştir ya da belki de, çünkü yorucu stimülasyon uring. Siklopiazonik asit (CPA), sarkoplazmik-endoplazmik retikulum kalsiyum ATPaz (SERCA), kafein, riyanodin kanal (RYR) bir agonisti bir reversible bloker tedavisi ve uyarımlar yorucu tekrarlanan tüm bu alternans doğrudan ilişkili düşündüren, mekanik alternansı ⁴ uyarabilir AK kaplin süreci modülasyonu. In vitro kontraktilite kurulum in mekanik alternansı indükleyen ve kaydetmek için yöntem Gösterme bireysel araştırma çıkarlara dayanan bu sistem, veya benzer olanlar ile elde edilebilir çeşitlendirilmiş deneysel parametreleri göstermek için bir örnek teşkil etmektedir.

Bu yöntem, kas fizyolojisi inceleyen araştırmacılar için ilgi çekici olabilir. Benzer ayarı da diğerinden izole iskelet muscle-tendon/ligament kompleksler için de kullanılabilirlokasyon, hem de tek liflerin ve kas şeritleri için olduğu gibi.

Protocol

Çözüm bileşimi: 2.5 mM Ca2 + Tyrode çözeltisi: 140 mM NaCl, 5 mM KCI, 10 mM HEPES, 2.5 mM CaCI2, 2 mM MgCI2 ve 10 mM glükoz 0 mM Ca2 + Tyrode çözeltisi: 140 mM NaCl, 5 mM KCI, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 0,1 mM etilen glikol tetraasetik asit (EGTA) ve 10 mM glükoz Not: banyo çözümü yukarıdaki çözüm kullanıyorsanız, ancak% 5 CO 2 ile% 95 O 2 ile%…

Discussion

Kasılma kuvveti ve kolay yorulma ölçülmesi iskelet kas fonksiyonunun genel değerlendirme için önemlidir. Bu testin ana amacı bu sarkopeni ve kas yorgunluğu gibi bazı patolojik şartlar altında kas kuvveti değişiklikleri ve yorucu özelliklerini tespit etmek, ve kas kasılma uyuşturucu / reaktiflerin etkisinin test etmektir. Kas kuvveti yakından hücre içi Ca ² ile ilişkili olduğu için ⁺ sürümü, ekstrasellüler ^{Ca2 +} girişi ve bu ikisi arasındaki karışma, biz de …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
2-APB	Tocris	1224	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and TRP etc.
SKF96365	Sigma	SKF-96365	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and receptor-mediated Ca2+ entry etc.
BTP-2	Millipore	203890-5MG	Relatively specific SOC blocker
CPA	Sigma	C1530	Reversible SERCA blocker
caffeine	Sigma	C0750	Fast action RyR agonist
Radnoti Four Unit Tissue Organ Bath System	Radnoti	159920
Combination Tissue Support/Stimulating Electrode	Radnoti	160151	Vertical Zig Zag Type with tissue support
Quad Bridge Amp	ADInstruments	FE224
PowerLab/400	ADInstruments		This product is no longer available. Choose other version of the data acquisition system.
Force Transducers (5 mg – 25 g)	ADInstruments	MLT0201/RAD
Chart v4.02	ADInstruments		LabChart 7.3 is the latest version of Chart software.
S8800 Dual Pulse Digital Stimulator	GRASS TECHNOLOGIES		This product is no longer available. S88X Dual Output Square Pulse Stimulator is a newer stimulator.
RF Transformer Isolation Unit	GRASS TECHNOLOGIES	Model SIU5