淀粉样前体蛋白胞内结构域的分离纯化和聚集
Summary
APP胞内结构域（AICD）用于大规模纯化的方法，进行说明。我们也将介绍的方法来诱导<em在体外</emAICD聚合和原子力显微镜的可视化。所描述的方法是有用的生化/结构表征AICD和聚集在其分子伴侣的影响。
Abstract
淀粉样前体蛋白（APP）是与阿尔茨海默氏病（AD）的发病机制相关联的I型跨膜蛋白。 APP是其特征在于由一个大的胞外结构域和一个短的胞质域称为APP胞内结构域（AICD）。在成熟过程中通过分泌途径，APP可以由蛋白酶被称为α，β，和γ-分泌1裂解。顺序的蛋白水解切割APP的β和γ-分泌导致一个小的蛋白水解肽，称为Aβ是淀粉样蛋白形成和老年斑的核心成分的生产。 AICD是从膜中解放出来后分泌处理，并通过FE65和TIP60的相互作用，可转位到细胞核内参与多个靶基因的转录调节2,3。蛋白质 – 蛋白质相互作用的AICD可能会影响贩运，加工，细胞功能的全息APP和C-termin人的片段。最近，我们已经表明，AICD可以聚集在体外 ，而这个过程被抑制的AD-牵连分子伴侣ubiquilin的，1 4。与这些结果一致，AICD暴露出疏水区，并有内在的紊乱体外 5,6，但它获得稳定的二级结构时，势必FE65 7。我们已经提出，ubiquilin-1防止AICD不适当间和分子内相互作用，防止聚集在体外和在完整细胞4。虽然大多数研究专注于APP在AD的发病机制中的作用，AICD在这个过程中的作用目前尚不清楚的。已被证明的表达AICD诱导细胞凋亡8，调制信号通路9，调节钙信号10。 AICD和FE65过度表达的转基因小鼠模型中诱导阿尔茨海默氏症样病变11日 ，并于最近AICD中发现了胸罩在裂解液免疫印迹当使用合适的抗原修复技术12。为了方便的AICD的结构，生化和生物物理研究，我们开发了一个程序，以重组产生大量的高纯度AICD蛋白。我们进一步对诱导在体外热聚集，的AICD并分析利用原子力显微镜的描述方法。描述的方法是有用的生物化学，生物物理与结构表征，AICD的影响AICD聚集的分子伴侣。
Protocol
Discussion
在这个协议中，我们提出的结构，生物物理和生物化学分析，获得高纯度的AICD的程序。此过程不需要复杂的色谱仪，因此大多数实验室访问。其他团体纯化的AICD 5-7,16，包括GST-AICD 17日至19日 ，生化/结构的分析。到先前的协议的缺点包括AICD 16的溶解性差，小于理想纯度17，和尺寸排阻16的要求，或反相色谱法6,20。因此，这里所描述的协议，极大地?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢郑晖博士（美国贝勒医学院）的APP基因。这个工作是由美国国立卫生研究院资助R21AG031948（DB，JMB），F30AG030878（ESS），R01DK073394（AFO），约翰·西利纪念基金会生物医学研究基金（AFO），并在Jean C.和威廉·D·威利斯神经研究基金（ESS）。 ，JMB是一个学者的翻译研究学者项目和大学的德克萨斯州医学科克劳德·E.辣椒年长美国人独立中心的成员（由美国国立卫生研究院资助UL1RR029876和P30-AG-024832，分别支持）。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| pGEX-4T-1 | GE Healthcare | 28-9545-49 | |
| Thrombin | GE Healthcare | 27-0846-01 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Bradford protein assay reagent | Bio-Rad | 500-0002 | |
| Coomassie blue | Bio-Rad | 161-0786 | |
| IPTG ( isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Glutathione-agarose | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| p-aminobenzamidine-agarose | Sigma-Aldrich | A7155 | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Slide-A-Lyzer dialysis cassettes | Thermo Scientific | 66380 | |
| Chromatography columns | Evergreen Scientific | 208-3367-050 | |
| Emulsifier | Avestin, Inc | EmulsiFlex-C3 | Highly recommended |
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670107 | |
| Mica Disks | Ted Pella | 50-12 | |
| AFM cantilevers | Bruker | MSNL-10 | |
| WSxM software | Nanotec | N/A | Free download |
References
- De Strooper, B., Vassar, R., Golde, T. The secretases: enzymes with therapeutic potential in Alzheimer disease. Nature reviews. Neurology. 6, 99-107 (2010).
- Chang, K. A., Suh, Y. H. Possible roles of amyloid intracellular domain of amyloid precursor protein. BMB reports. 43, 656-663 (2010).
- McLoughlin, D. M., Miller, C. C. The FE65 proteins and Alzheimer’s disease. J. Neurosci. Res. 86, 744-754 (2008).
- Stieren, E. S. Ubiquilin-1 is a molecular chaperone for the amyloid precursor protein. J. Biol. Chem. 286, 35689-35698 (2011).
- Ramelot, T. A., Nicholson, L. K. Phosphorylation-induced structural changes in the amyloid precursor protein cytoplasmic tail detected by NMR. J. Mol. Biol. 307, 871-884 (2001).
- Ramelot, T. A., Gentile, L. N. Transient structure of the amyloid precursor protein cytoplasmic tail indicates preordering of structure for binding to cytosolic factors. Biochem. 39, 2714-2725 (2000).
- Radzimanowski, J. Structure of the intracellular domain of the amyloid precursor protein in complex with Fe65-PTB2. EMBO Rep. 9, 1134-1140 (2008).
- Ohkawara, T., Nagase, H., Koh, C. S., Nakayama, K. The amyloid precursor protein intracellular domain alters gene expression and induces neuron-specific apoptosis. Gene. 475, 1-9 (2011).
- von Rotz, R. C. The APP intracellular domain forms nuclear multiprotein complexes and regulates the transcription of its own precursor. J. Cell Sci. 117, 4435-4448 (2004).
- Hamid, R. Amyloid precursor protein intracellular domain modulates cellular calcium homeostasis and ATP content. J. Neurochem. 102, 1264-1275 (2007).
- Ghosal, K., Stathopoulos, A., Pimplikar, S. W. APP intracellular domain impairs adult neurogenesis in transgenic mice by inducing neuroinflammation. PLoS ONE. 5, e11866 (2010).
- Pimplikar, S. W., Suryanarayana, A. Detection of APP intracellular domain in brain tissue. Met. Molecul. Biol. 670, 85-91 (2011).
- Buchner, J., Grallert, H., Jakob, U. Analysis of chaperone function using citrate synthase as nonnative substrate protein. Met. Enzymol. 290, 323-338 (1998).
- Hansma, H. G. Recent advances in atomic force microscopy of DNA. Scanning. 15, 296-299 (1993).
- Valbuena, A. Quasi-simultaneous imaging/pulling analysis of single polyprotein molecules by atomic force microscopy. Rev. Sci. Instrum. 78, 113707 (2007).
- Radzimanowski, J., Beyreuther, K., Sinning, I., Wild, K. Overproduction, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of human Fe65-PTB2 in complex with the amyloid precursor protein intracellular domain. Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 409-412 (2008).
- Chen, T. Y., Liu, P. H., Ruan, C. T., Chiu, L., Kung, F. L. The intracellular domain of amyloid precursor protein interacts with flotillin-1, a lipid raft protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 342, 266-272 (2006).
- Kim, M. Y. Regulation of Notch1 signaling by the APP intracellular domain facilitates degradation of the Notch1 intracellular domain and RBP-Jk. J. Cell Sci. 124, 1831-1843 (2011).
- Lazarov, O. Axonal transport, amyloid precursor protein, kinesin-1, and the processing apparatus: revisited. J. Neurosci. 25, 2386-2395 (2005).
- Kakuda, N. Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase. J Biol. Chem. 281, 14776-14786 (2006).
- Gosal, W. S., Myers, S. L., Radford, S. E., Thomson, N. H. Amyloid under the atomic force microscope. Protein Pept. Lett. 13, 261-270 (2006).
