Reinigung und Aggregation des Amyloid Precursor Protein intrazelluläre Domäne
Summary
Ein Verfahren für die großtechnische Reinigung des APP intrazelluläre Domäne (AICD) beschrieben. Wir beschreiben auch Methoden zu induzieren<em> In vitro</em> AICD Aggregation und Visualisierung mittels Rasterkraftmikroskopie. Die beschriebenen Methoden sind nützlich für biochemische / strukturelle Charakterisierung der AICD und die Auswirkungen der molekularen Chaperone auf die Aggregation.
Abstract
Amyloid-Vorläuferprotein (APP) ist ein Typ I Transmembran-Proteins mit der Pathogenese der Alzheimer-Krankheit (AD) zugeordnet ist. APP wird durch einen großen extrazellulären Domäne und einer kurzen zytosolische Domäne bezeichnet das APP intrazelluläre Domäne (AICD) aufweist. Während der Reifung durch den sekretorischen Weg, kann APP durch Proteasen genannt α, β und γ-Sekretase 1 gespalten werden. Sequentielle proteolytische Spaltung von APP mit β und γ-Sekretasen führt zu der Produktion eines kleinen Peptids proteolytische, genannt Aß, das amyloidogene ist und der Kernbestandteil von senilen Plaques. Die AICD ist auch befreit von der Membran nach Sekretase Verarbeitung und durch Interaktionen mit Fe65 und Tip60 kann in den Kern in Transkriptionsregulation mehrerer Zielgene 2,3 teilzunehmen translozieren. Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen den AICD beeinträchtigen Menschenhandel, Verarbeitung und zelluläre Funktionen von Holo-APP und seine C-terminal Fragmente. Wir haben kürzlich gezeigt, dass AICD wird Aggregat kann in vitro, und dieser Prozess durch den AD-verwickelt molekularen Chaperon Ubiquilin-1 4 inhibiert. Übereinstimmend mit diesen Ergebnissen, die AICD hat hydrophoben Domänen ausgesetzt und ist untrennbar in vitro 5,6 ungeordnet, aber es erhält stabile sekundäre Struktur, wenn sie Fe65 7 gebunden. Wir haben vorgeschlagen, dass Ubiquilin-1 unangemessen inter-und intramolekulare Wechselwirkungen von AICD verhindert die Aggregation in vitro und in intakten Zellen 4. Während die meisten Studien über die Rolle von APP in der Pathogenese von AD zu konzentrieren, ist die Rolle in diesem Prozess AICD nicht klar. Expression AICD hat sich gezeigt, Apoptose zu induzieren 8, zu modulieren Signalwege 9 und zum Calcium regulieren Signalisierung 10. Überexpression von AICD und Fe65 in einer transgenen Mausmodell induziert wie Alzheimer Pathologie 11, und vor kurzem hat AICD in BH nachgewiesenin Lysaten mittels Western Blot, wenn mit geeigneten Antigen-Retrieval-Techniken 12. Um strukturelle, biochemische und biophysikalische Untersuchungen des AICD erleichtern, haben wir ein Verfahren zur rekombinanten große Mengen an hochreinem AICD Protein produzieren. Wir beschreiben außerdem ein Verfahren zur Induktion der in vitro thermische Aggregation AICD und Analyse mittels Rasterkraftmikroskopie. Die beschriebenen Methoden sind für biochemische, biophysikalische und strukturelle Charakterisierung des AICD und die Auswirkungen der molekularen Chaperone auf AICD Aggregation nützlich.
Protocol
Discussion
In diesem Protokoll haben wir ein Verfahren zur Gewinnung von hochreinem AICD für strukturelle, biophysikalischen und biochemischen Analysen skizziert. Dieses Verfahren erfordert keine ausgeklügelte Chromatographie Geräte und ist damit zugänglich für die meisten Laboratorien. Andere Gruppen haben AICD 5-7,16 gereinigt, einschließlich GST-AICD 17-19, für biochemische / Strukturanalysen. Nachteile zu früheren Protokollen gehören schlechte Löslichkeit von AICD 16, weniger als idea…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Dr. Hui Zheng (Baylor College of Medicine) für die APP cDNA danken. Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (AFO), die John Sealy Memorial Endowment Fund for Biomedical Research (AFO) und der Jean C. und William D. Willis Neuroscience Research Endowment finanziert (ESS). JMB ist ein Gelehrter in der Translational Research Scholar Program und ein Mitglied der University Of Texas Medical Branch Claude E. Pfeffer Ältere Amerikaner Independence Center (unterstützt durch NIH Grants UL1RR029876 und P30-AG-024.832, jeweils).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| pGEX-4T-1 | GE Healthcare | 28-9545-49 | |
| Thrombin | GE Healthcare | 27-0846-01 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Bradford protein assay reagent | Bio-Rad | 500-0002 | |
| Coomassie blue | Bio-Rad | 161-0786 | |
| IPTG ( isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Glutathione-agarose | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| p-aminobenzamidine-agarose | Sigma-Aldrich | A7155 | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Slide-A-Lyzer dialysis cassettes | Thermo Scientific | 66380 | |
| Chromatography columns | Evergreen Scientific | 208-3367-050 | |
| Emulsifier | Avestin, Inc | EmulsiFlex-C3 | Highly recommended |
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670107 | |
| Mica Disks | Ted Pella | 50-12 | |
| AFM cantilevers | Bruker | MSNL-10 | |
| WSxM software | Nanotec | N/A | Free download |
References
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