アミロイド前駆体タンパク質細胞内ドメインの精製と集約
Summary
APPの細胞内ドメイン（AICD）の大規模な精製のための方法が記載されている。我々はまた、誘導する方法を説明します<em> in vitroで</em原子間力顕微鏡による> AICD集約と可視化。記載されている方法は、構造的/生化学AICDの特性とその凝集分子シャペロンの効果のために有用である。
Abstract
アミロイド前駆体タンパク質（APP）はアルツハイマー病（AD）の発症に関連するI型膜貫通タンパク質である。 APPはAPPの細胞内ドメイン（AICD）と呼ばれる大きな細胞外ドメインおよび短い細胞質ドメインによって特徴づけられる。分泌経路を介して成熟中に、APPは、α、β、γ-セクレターゼ1と呼ばれるプロテアーゼによって切断することができる。 β、γ-セクレターゼによるAPPのシーケンシャルタンパク質分解切断は小さなタンパク質分解ペプチドと呼ばれるAβ、アミロイド形成であり、老人斑のコア成分の生産につながる。 AICDはセクレターゼ処理後も膜から遊離され、Fe65とTIP60との相互作用を介して、複数の標的遺伝子2,3の転写調節に関与する核に移行することができます。 AICDを含む、タンパク質 – タンパク質相互作用は、人身売買、加工、ホロAPPおよびそのC-TERMINの細胞機能に影響を及ぼす可能性がアルの断片。我々は最近、AICDがAD-関与する分子シャペロンubiquilin-1 4により阻害され、in vitroで集計され、このプロセスができることを示している。 Fe65 7にバインドされたときに、これらの知見と一致して、AICDは、疎水性ドメインを露出しており、本質的にin vitroで 5,6 で乱れる、しかしそれは安定な二次構造を取得します。我々はubiquilin-1は、in vitroおよび4無傷細胞における凝集防止、AICDの不適切な分子間及び分子内相互作用を防止することを提案した。ほとんどの研究は、ADの病因におけるAPPの役割に焦点を当てる一方で、このプロセスにおけるAICDの役割は明らかではありません。 AICDの発現はアポトーシス8,9シグナル伝達経路を調節するため、10のシグナリングカルシウムを調節することを誘導することが示されている。 AICDの過剰発現およびトランスジェニックマウスモデルにおけるFe65アルツハイマー病理11等を誘発し、最近AICDがブラジャーで検出されている適切な抗原検索技術12を使用するときにウェスタンブロッティングによりライセートインチAICDの、構造的、生化学的、および生物物理学的研究を促進するために、我々は非常に純粋なAICDタンパク質の組換えを大量に生成するための手順を開発しました。我々は、さらに原子間力顕微鏡によるAICDと分析の in vitro熱凝集に誘導する方法を説明します。記載されている方法は、生化学生物物理学、構造AICDの特性評価およびAICD凝集分子シャペロンの効果のために有用である。
Protocol
Discussion
このプロトコルでは、構造生物物理、生化学的解析のための高純度AICDを取得するための手順を説明してきました。この手順では、洗練されたクロマトグラフ装置を必要とするため、ほとんどの研究室にアクセス可能であることはありません。他のグループは、構造的/生化学分析のために、GST-AICD 17から19を含め、AICD 5-7,16を精製しました。以前のプロトコルの欠点は貧しいAICD…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、cDNAのアプリのための博士ホイ鄭（ベイラー医科大学）に感謝したいと思います。この作品は、NIHの助成R21AG031948（DB、JMB）、F30AG030878（ESS）R01DK073394（AFO）、生物医学研究のためのジョン·シーリー·メモリアル基金基金（AFO）、ジャン℃、ウィリアム·D·ウィリス脳神経情報研究基金によって資金を供給された（ESS）を表示します。 JMBはトランスレーショナル研究奨学生プログラムにおける学者とテキサスメディカルブランチクロード·E·ペッパー古いアメリカ人はインディペンデンスセンターの大学のメンバー（NIHのグラントそれぞれUL1RR029876およびP30-AG-024832、でサポートされている）です。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| pGEX-4T-1 | GE Healthcare | 28-9545-49 | |
| Thrombin | GE Healthcare | 27-0846-01 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Bradford protein assay reagent | Bio-Rad | 500-0002 | |
| Coomassie blue | Bio-Rad | 161-0786 | |
| IPTG ( isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Glutathione-agarose | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| p-aminobenzamidine-agarose | Sigma-Aldrich | A7155 | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Slide-A-Lyzer dialysis cassettes | Thermo Scientific | 66380 | |
| Chromatography columns | Evergreen Scientific | 208-3367-050 | |
| Emulsifier | Avestin, Inc | EmulsiFlex-C3 | Highly recommended |
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670107 | |
| Mica Disks | Ted Pella | 50-12 | |
| AFM cantilevers | Bruker | MSNL-10 | |
| WSxM software | Nanotec | N/A | Free download |
References
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