Очистка и агрегации белка-предшественника амилоида внутриклеточного домена
Summary
Метод крупномасштабной очистки APP внутриклеточного домена (AICD) описывается. Мы также описать методологию, чтобы побудить<em> В пробирке</em> AICD агрегирования и визуализации атомно-силовой микроскопии. Описанные методы могут быть использованы для биохимических / структурных характеристик AICD и последствия молекулярных шаперонов на его агрегации.
Abstract
Белка-предшественника амилоида (APP) представляет собой трансмембранный типа я белка, связанного с патогенезом болезни Альцгеймера (AD). APP характеризуется большой внеклеточный домен и короткий цитозольного домена называется APP внутриклеточного домена (AICD). Во время созревания через секреторный путь, APP могут расщепляться протеазами называется α, β, γ и-секретазы 1. Последовательное протеолитического расщепления APP с β и γ-секретазы приводит к образованию небольшого пептида протеолитические, называется Ар, который является амилоидогенных и основной составляющей старческих бляшек. AICD также освобожден от мембраны после обработки секретазы, и через взаимодействие с Fe65 и Tip60, можно перемещать в ядро участвовать в регуляции транскрипции нескольких генов-мишеней 2,3. Белок-белковые взаимодействия, связанные с AICD могут повлиять на торговлю, обработку и клеточных функций голо-APP и C-терминологиюАль-фрагментов. Недавно мы показали, что AICD можете совокупности в пробирке, и этот процесс тормозится AD-замешан молекулярного шаперона ubiquilin-1 4. В соответствии с этими выводами, AICD выявила гидрофобных доменов, и внутренне неупорядоченным в пробирке 5,6, однако он получает стабильную вторичную структуру при связывании с Fe65 7. Мы предположили, что ubiquilin-1 предотвращает нарушение меж-и внутримолекулярных взаимодействий AICD, предотвращая агрегацию в пробирке и в неповрежденные клетки 4. Хотя большинство исследований сосредоточена на роли АЭС в патогенезе БА, роль AICD в этом процессе не ясно. Выражение AICD было показано, индуцируют апоптоз 8, для модуляции сигнальных путей, 9 и регулировать кальция сигнализации 10. Сверхэкспрессия AICD и Fe65 в трансгенных мышах вызывает болезнь Альцгеймера, как патология 11, а в последнее время AICD был обнаружен в бюстгальтерВ лизатов с помощью вестерн-блоттинга при использовании соответствующего антигена поиска методов 12. Для облегчения структурных, биохимических и биофизических исследований AICD, мы разработали процедуру для получения рекомбинантных большого количества очень чистой AICD белка. Мы также описать способ индуцирования в пробирке тепловой агрегации AICD и анализ атомно-силовой микроскопии. Методы, описанные полезны для биохимических, биофизических и структурных характеристик AICD и последствия молекулярных шаперонов на AICD агрегации.
Protocol
Discussion
В этом протоколе мы наметили порядок получения особо чистой AICD для структурных, биофизических и биохимических анализов. Эта процедура не требует сложного оборудования хроматографии и, следовательно, доступными для большинства лабораторий. Другие группы, очистив AICD 5-7,16, в том чи?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Хуэй Чжэн (Медицинского колледжа Бэйлора) для APP кДНК. Эта работа финансировалась грантами NIH R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (АФК), Джон Сили мемориальный благотворительный фонд для биомедицинских исследований (АФК), и Жан С. и Уильяма Д. Уиллис Neuroscience исследований фонда (ESS). JMB является ученым в Поступательное Программа научный сотрудник и член Техасском университете Медицинского отделения Клод Пеппер пожилых американцев Независимости центра (при поддержке грантов NIH UL1RR029876 и P30-AG-024 832, соответственно).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| pGEX-4T-1 | GE Healthcare | 28-9545-49 | |
| Thrombin | GE Healthcare | 27-0846-01 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Bradford protein assay reagent | Bio-Rad | 500-0002 | |
| Coomassie blue | Bio-Rad | 161-0786 | |
| IPTG ( isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Glutathione-agarose | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| p-aminobenzamidine-agarose | Sigma-Aldrich | A7155 | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Slide-A-Lyzer dialysis cassettes | Thermo Scientific | 66380 | |
| Chromatography columns | Evergreen Scientific | 208-3367-050 | |
| Emulsifier | Avestin, Inc | EmulsiFlex-C3 | Highly recommended |
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670107 | |
| Mica Disks | Ted Pella | 50-12 | |
| AFM cantilevers | Bruker | MSNL-10 | |
| WSxM software | Nanotec | N/A | Free download |
References
- De Strooper, B., Vassar, R., Golde, T. The secretases: enzymes with therapeutic potential in Alzheimer disease. Nature reviews. Neurology. 6, 99-107 (2010).
- Chang, K. A., Suh, Y. H. Possible roles of amyloid intracellular domain of amyloid precursor protein. BMB reports. 43, 656-663 (2010).
- McLoughlin, D. M., Miller, C. C. The FE65 proteins and Alzheimer’s disease. J. Neurosci. Res. 86, 744-754 (2008).
- Stieren, E. S. Ubiquilin-1 is a molecular chaperone for the amyloid precursor protein. J. Biol. Chem. 286, 35689-35698 (2011).
- Ramelot, T. A., Nicholson, L. K. Phosphorylation-induced structural changes in the amyloid precursor protein cytoplasmic tail detected by NMR. J. Mol. Biol. 307, 871-884 (2001).
- Ramelot, T. A., Gentile, L. N. Transient structure of the amyloid precursor protein cytoplasmic tail indicates preordering of structure for binding to cytosolic factors. Biochem. 39, 2714-2725 (2000).
- Radzimanowski, J. Structure of the intracellular domain of the amyloid precursor protein in complex with Fe65-PTB2. EMBO Rep. 9, 1134-1140 (2008).
- Ohkawara, T., Nagase, H., Koh, C. S., Nakayama, K. The amyloid precursor protein intracellular domain alters gene expression and induces neuron-specific apoptosis. Gene. 475, 1-9 (2011).
- von Rotz, R. C. The APP intracellular domain forms nuclear multiprotein complexes and regulates the transcription of its own precursor. J. Cell Sci. 117, 4435-4448 (2004).
- Hamid, R. Amyloid precursor protein intracellular domain modulates cellular calcium homeostasis and ATP content. J. Neurochem. 102, 1264-1275 (2007).
- Ghosal, K., Stathopoulos, A., Pimplikar, S. W. APP intracellular domain impairs adult neurogenesis in transgenic mice by inducing neuroinflammation. PLoS ONE. 5, e11866 (2010).
- Pimplikar, S. W., Suryanarayana, A. Detection of APP intracellular domain in brain tissue. Met. Molecul. Biol. 670, 85-91 (2011).
- Buchner, J., Grallert, H., Jakob, U. Analysis of chaperone function using citrate synthase as nonnative substrate protein. Met. Enzymol. 290, 323-338 (1998).
- Hansma, H. G. Recent advances in atomic force microscopy of DNA. Scanning. 15, 296-299 (1993).
- Valbuena, A. Quasi-simultaneous imaging/pulling analysis of single polyprotein molecules by atomic force microscopy. Rev. Sci. Instrum. 78, 113707 (2007).
- Radzimanowski, J., Beyreuther, K., Sinning, I., Wild, K. Overproduction, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of human Fe65-PTB2 in complex with the amyloid precursor protein intracellular domain. Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 409-412 (2008).
- Chen, T. Y., Liu, P. H., Ruan, C. T., Chiu, L., Kung, F. L. The intracellular domain of amyloid precursor protein interacts with flotillin-1, a lipid raft protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 342, 266-272 (2006).
- Kim, M. Y. Regulation of Notch1 signaling by the APP intracellular domain facilitates degradation of the Notch1 intracellular domain and RBP-Jk. J. Cell Sci. 124, 1831-1843 (2011).
- Lazarov, O. Axonal transport, amyloid precursor protein, kinesin-1, and the processing apparatus: revisited. J. Neurosci. 25, 2386-2395 (2005).
- Kakuda, N. Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase. J Biol. Chem. 281, 14776-14786 (2006).
- Gosal, W. S., Myers, S. L., Radford, S. E., Thomson, N. H. Amyloid under the atomic force microscope. Protein Pept. Lett. 13, 261-270 (2006).
