Amiloid prekürsör protein intrasellüler Domain saflaştırılması ve toplama
Summary
APP hücre içi etki alanı (AICD) büyük ölçekli arıtma için bir yöntem tarif edilmektedir. Ayrıca teşvik etmek için yöntemler tarifedilmiştir<em> In vitro</emAtomik kuvvet mikroskobu ile> AICD agregasyonu ve görselleştirme. Açıklanan yöntemler / biyokimyasal yapı AICD karakterizasyonu ve agregasyonu üzerinde moleküler şaperonlar etkileri için yararlıdır.
Abstract
Amiloid prekürsör protein (APP) Alzheimer hastalığı (AH) patogenezi ile ilişkili bir tip I transmembran proteindir. APP büyük ekstrasellüler domain ve APP hücre içi etki alanı (AICD) olarak adlandırılan kısa bir sitosolik etki ile karakterize edilir. Salgı yolu ile olgunlaşma sırasında, APP α, β, ve γ-secretases 1 olarak adlandırılan proteaz tarafından bölünebilir. Ve γ-β secretases ile APP ardışık proteolitik bölünme bir küçük peptid proteolitik olarak adlandırıldı, Aβ, amiloidojenik ve senil plaklar çekirdek bileşenin üretimine yol açar. AICD sekretaz işlendikten sonra da membran kurtarılmasının ve Fe65 ve Tip60 olan etkileşimleri sayesinde, birden fazla hedef genlerin 2,3 transkripsiyon regülasyonu katılmaya çekirdeğine doğru olabilir. AICD içeren protein-protein etkileşimleri ticareti, işlenmesi, ve sanal-APP ve C-termin hücresel fonksiyonları etkileyebilirark parçaları. Biz son zamanlarda AICD AD-karıştığı moleküler şaperon ubiquilin-1 4 tarafından inhibe edilir vitro agrega ve bu süreç olduğunu göstermiştir. Fe65 7 bağlı olduğunda bu bulgularla tutarlı olarak, AICD hidrofobik etki ortaya çıkarmıştır ve kendinden vitro 5,6 olarak bozulup, ancak kararlı ikincil yapı alır. Biz ubiquilin-1 in vitro ve 4 sağlam hücreleri agregasyonu engelleyen AICD uygunsuz arası ve molekül içi etkileşimleri engeller önerdi. Çalışmaların çoğu AD patogenezinde APP rolü üzerinde odaklanırken, bu süreçte AICD rolü net değildir. AICD ekspresyonu sinyal yollarının 9 modüle etmek için, apoptoz 8 indüklemek için, ve 10 sinyal kalsiyum düzenleme gösterilmiştir. Bir transgenik fare modelinde AICD ve Fe65 Over ifade patolojisi 11 gibi Alzheimer indükler ve son zamanlarda AICD sutyen tespit edildiUygun antijen geri kazanım teknikleri 12 kullanırken batı blot tarafından özütündeki. AICD yapısal, biyokimyasal ve biyofiziksel çalışmaları kolaylaştırmak için, biz çok saf AICD protein Birleştirilerek büyük miktarlarda üretmek için bir prosedür geliştirmiştir. Daha ileri atomik kuvvet mikroskopi ile analiz AICD ve in vitro termal agregasyonu indüklenmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. Açıklanan yöntemler, biyokimyasal biyo-fiziksel, ve yapısal AICD karakterizasyonu ve AICD agregasyonu üzerinde moleküler şaperonlar etkileri için yararlıdır.
Protocol
Discussion
Bu protokolü biz, yapısal biyofiziksel ve biyokimyasal analizler için son derece saf AICD elde etmek için bir prosedürü var. Bu işlem karmaşık kromatografi ekipman gerektiren ve bu nedenle birçok laboratuar erişilebilir değil. Diğer gruplar / biyokimyasal yapısal analizler için GST-AICD 17-19 dahil AICD 5-7,16 saflaştırılmış var. Önceki protokol dezavantajları zayıf AICD 16, çözünürlük, ideal bir saflık 17 den daha az, ve boyut dışlama 16</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar cDNA APP Dr Hui Zheng (Baylor College of Medicine) teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NIH hibe R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (AFO), Biyomedikal Araştırma John Sealy Memorial Endowment Fund (AFO), ve Jean C. ve William D. Willis Nöroloji Araştırma Vakfı tarafından finanse edildi (ESS). JMB Translasyonel Araştırmacı Programı, bir bilgin ve Texas Medical Branch Claude E. Pepper Eski Amerikalıların Bağımsızlık Merkezi Of Üniversitesi üyesi (NIH Grants sırasıyla UL1RR029876 ve P30-AG-024832, tarafından desteklenen) 'dir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| pGEX-4T-1 | GE Healthcare | 28-9545-49 | |
| Thrombin | GE Healthcare | 27-0846-01 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Bradford protein assay reagent | Bio-Rad | 500-0002 | |
| Coomassie blue | Bio-Rad | 161-0786 | |
| IPTG ( isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Glutathione-agarose | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| p-aminobenzamidine-agarose | Sigma-Aldrich | A7155 | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Slide-A-Lyzer dialysis cassettes | Thermo Scientific | 66380 | |
| Chromatography columns | Evergreen Scientific | 208-3367-050 | |
| Emulsifier | Avestin, Inc | EmulsiFlex-C3 | Highly recommended |
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670107 | |
| Mica Disks | Ted Pella | 50-12 | |
| AFM cantilevers | Bruker | MSNL-10 | |
| WSxM software | Nanotec | N/A | Free download |
References
- De Strooper, B., Vassar, R., Golde, T. The secretases: enzymes with therapeutic potential in Alzheimer disease. Nature reviews. Neurology. 6, 99-107 (2010).
- Chang, K. A., Suh, Y. H. Possible roles of amyloid intracellular domain of amyloid precursor protein. BMB reports. 43, 656-663 (2010).
- McLoughlin, D. M., Miller, C. C. The FE65 proteins and Alzheimer’s disease. J. Neurosci. Res. 86, 744-754 (2008).
- Stieren, E. S. Ubiquilin-1 is a molecular chaperone for the amyloid precursor protein. J. Biol. Chem. 286, 35689-35698 (2011).
- Ramelot, T. A., Nicholson, L. K. Phosphorylation-induced structural changes in the amyloid precursor protein cytoplasmic tail detected by NMR. J. Mol. Biol. 307, 871-884 (2001).
- Ramelot, T. A., Gentile, L. N. Transient structure of the amyloid precursor protein cytoplasmic tail indicates preordering of structure for binding to cytosolic factors. Biochem. 39, 2714-2725 (2000).
- Radzimanowski, J. Structure of the intracellular domain of the amyloid precursor protein in complex with Fe65-PTB2. EMBO Rep. 9, 1134-1140 (2008).
- Ohkawara, T., Nagase, H., Koh, C. S., Nakayama, K. The amyloid precursor protein intracellular domain alters gene expression and induces neuron-specific apoptosis. Gene. 475, 1-9 (2011).
- von Rotz, R. C. The APP intracellular domain forms nuclear multiprotein complexes and regulates the transcription of its own precursor. J. Cell Sci. 117, 4435-4448 (2004).
- Hamid, R. Amyloid precursor protein intracellular domain modulates cellular calcium homeostasis and ATP content. J. Neurochem. 102, 1264-1275 (2007).
- Ghosal, K., Stathopoulos, A., Pimplikar, S. W. APP intracellular domain impairs adult neurogenesis in transgenic mice by inducing neuroinflammation. PLoS ONE. 5, e11866 (2010).
- Pimplikar, S. W., Suryanarayana, A. Detection of APP intracellular domain in brain tissue. Met. Molecul. Biol. 670, 85-91 (2011).
- Buchner, J., Grallert, H., Jakob, U. Analysis of chaperone function using citrate synthase as nonnative substrate protein. Met. Enzymol. 290, 323-338 (1998).
- Hansma, H. G. Recent advances in atomic force microscopy of DNA. Scanning. 15, 296-299 (1993).
- Valbuena, A. Quasi-simultaneous imaging/pulling analysis of single polyprotein molecules by atomic force microscopy. Rev. Sci. Instrum. 78, 113707 (2007).
- Radzimanowski, J., Beyreuther, K., Sinning, I., Wild, K. Overproduction, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of human Fe65-PTB2 in complex with the amyloid precursor protein intracellular domain. Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 409-412 (2008).
- Chen, T. Y., Liu, P. H., Ruan, C. T., Chiu, L., Kung, F. L. The intracellular domain of amyloid precursor protein interacts with flotillin-1, a lipid raft protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 342, 266-272 (2006).
- Kim, M. Y. Regulation of Notch1 signaling by the APP intracellular domain facilitates degradation of the Notch1 intracellular domain and RBP-Jk. J. Cell Sci. 124, 1831-1843 (2011).
- Lazarov, O. Axonal transport, amyloid precursor protein, kinesin-1, and the processing apparatus: revisited. J. Neurosci. 25, 2386-2395 (2005).
- Kakuda, N. Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase. J Biol. Chem. 281, 14776-14786 (2006).
- Gosal, W. S., Myers, S. L., Radford, S. E., Thomson, N. H. Amyloid under the atomic force microscope. Protein Pept. Lett. 13, 261-270 (2006).
