Skille funksjonelle roller av genuttrykk fra immune og ikke-immune celler i mus Kolitt av benmargstransplantasjon

Summary

Benmargstransplantasjon gir en måte å endre genotype i benmargen avledet celler. Dersom genet av interesse er uttrykt i begge benmargsceller avledet celler og ikke-benmarg avledet celler, kan benmargstransplantasjon endre benmargsceller avledet celler til en annen uten å endre genotypen ikke-beinmargen avledet celle genotype.

Abstract

For å forstå hvilken rolle et gen i utviklingen av kolitt, sammenlignet vi svarene på villtype mus og gen-of-interesse mangelfull knockout mus til kolitt. Hvis genet-of-interesse uttrykkes i begge benmargsceller avledet celler og ikke-benmarg avledet celler av verten, men, er det mulig å differensiere rollen av et gen av interesse i benmarg avledet celler og ikke-benmarg avledet celler ved benmargstransplantasjon teknikk. Å endre benmargen avledet celle genotype av mus, ble den opprinnelige benmargen mottakerland mus ødelagt av stråling og deretter erstattet av ny donor benmarg av ulike genotype. Når villtype mus donor beinmargen ble transplantert til knockout-mus, kan vi generere knockout mus med villtype genuttrykk i benmarg avledet celler. Alternativt ble da knockout mus donor beinmargen transplantert til villtype mottaker mus, villtype mus uten gen-of-interesse uttrykkerfra benmarg avledet celler ble produsert. Imidlertid kan benmargstransplantasjon ikke være 100% fullført. Derfor benyttet vi klynge av differensiering (CD) molekyler (CD45.1 og CD45.2) som markører for donor og mottaker celler å spore andelen donor benmarg avledet celler i mottakerlandene mus og suksess av benmargstransplantasjon. Villtype mus med CD45.1 genotype og knockout mus med CD45.2 genotype ble brukt. Etter bestråling av mottaker mus ble donor benmargsceller forskjellige genotyper infunderes i mottakeren mus. Når den nye beinmargen regenereres til overta dens immunitet, ble musene utfordret av kjemisk middel (dekstran natriumsulfat DSS 5%) for å indusere kolitt. Her finner vi også viste metode for å indusere kolitt i mus og vurdere rollen til genet av interesse uttrykt fra benmarg avledet celler. Hvis genet-of-interesse fra beinet avledet cellene spiller en viktig rolle i utviklingen av sykdommen (som colitis), kan fenotypen av mottaker mus med benmargstransplantasjon bli betydelig endret. På slutten av kolitt eksperimenter, benmargen avledet celler i blod og benmarg ble merket med antistoffer mot CD45.1 og CD45.2 og deres kvantitative forholdet eksistens kan brukes for å vurdere effekten av benmargstransplantasjon ved strømningscytometri. Vellykket benmargstransplantasjon skal vise et stort flertall av donor genotype (på sikt av CD molekyl markør) over mottakeren genotype i både benmarg og blod mottaker mus.

Protocol

1. Før-du-start tekniske hensyn Vi anbefaler at du bruker både C57/BL6 villtype mus og knockout mus for eksperimentet fordi mus med tilsvarende CD molekyler kan kjøpes fra store mus leverandører. Siden det er vanskelig å spore villtype mus og knockout-mus avledet donorceller etter benmargstransplantasjon, er det nødvendig å bruke CD45.1 mus å representere villtype mus. (CD45.1 C57/SJL WT mus Jackson Laboratories lager # 002014). De fleste mus koloniene er CD45.2. Våre knockout mus…

Representative Results

Hvis gen-of-interesse spiller en betydelig rolle i immunceller under utvikling av kolitt, musene fikk beinmarg av ulike genotype gjennom benmargstransplantasjon (WT til KO eller KO til WT) bør ha en endret respons på DSS kolitt. En av de viktigste parametre for å bestemme graden av kolitt er H & E farging av colonic vev. Colonic vev struktur endringer og tegn på betennelse kan være kvantitativt evaluert av H & E histologi scoring system. Kriterier for H & E histologi scoring for DSS kolitt modellen kan …

Discussion

Denne benmargstransplantasjon tilnærming er egnet for immunologi forskning av kolitt, infeksjon, kreft, fedme og andre sykdommer. Denne benmargstransplantasjon eksperimentet trengs når genet-of-interesse uttrykkes i både beinmargen avledet og ikke-benmargsceller avledet celler og genet-of-interesse mistenkes å mediere sykdom ved celler fra enten populasjonen. For eksempel, er antimikrobielle peptidet cathelicidin vist å modulere akutt kolitt. Men det er uttrykt i både epitelceller og immunceller (for eksempel makr…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Cell staining buffer	Biolegend	#420201
10X RBC lysis buffer	Biolegend	#420301
FITC mouse isotype control	Biolegend	#400207
PE mouse isotype control	Biolegend	#400211
PE anti-mouse CD45.2	Biolegend	#109807
FITC anti-mouse CD45.1	Biolegend	#110705
Anti-mouse CD16/32 blocking	Biolegend	#101301
40 μm cell strainer	Fisherbrand	#22363547
PBS 1X	MP biomedicals	#1860454
Heparin	Fisherbrand	#BP2425
Sulfatrim (SMZ)	Qualitest	NC9242720 (fisher)
Lysol IC	Andwin Scientific	NC9745686 (fisher)
Vaccutainer	BD	#8000813
Mouse restrainer	Braintree Scientific	#TV-150
Irradiator	J.L. Shepherd and Associates	Mark I 68A
Flow cytometer	BD	BD FACSCanto II
Flow cytometer test tube	Falcon	#352052
Digital caliper	Fisherbrand	14-648-17
Hemoccult ICT	Beckman Coulter	G0328QW