Werkwijzen voor het ontwikkelen en valideren van een kwantitatieve fluorescentie assay voor het meten van de activiteit van de actieve gelijkrichter kalium (Kir) kanalen voor high-throughput screening verbinding gepresenteerd.
Specifieke leden van de regeling actieve gelijkrichter kalium (Kir) kanaal familie worden gepostuleerd drug targets voor een verscheidenheid van aandoeningen, waaronder hypertensie, atriumfibrilleren, en pijn 1,2. Voor het grootste deel, echter, is de vooruitgang in de richting van het begrijpen van hun therapeutisch potentieel of zelfs elementaire fysiologische functies is vertraagd door het gebrek aan goede farmacologische tools. Inderdaad, de moleculaire farmacologie van de actieve gelijkrichter familie ver achter die van de S4 superfamilie van voltage-gated kalium (Kv) kanalen, waarbij een aantal nanomolaire affiniteit en zeer selectieve modulatoren peptide toxine ontdekt 3. De bijengif toxine tertiapin en derivaten daarvan zijn krachtige remmers van Kir1.1 en Kir3 kanalen 4,5, maar peptiden een beperkt nut therapeutisch als experimenteel vanwege hun antigene eigenschappen en slechte biologische beschikbaarheid, metabolische stabiliteit en weefsel penetrantie. De ontwikkeling van krachtigeen selectieve kleine moleculen sondes met verbeterde farmacologische eigenschappen zal een sleutel tot het volledig begrijpen van de fysiologie en therapeutisch potentieel van Kir-kanalen zijn.
De Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN), ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) Gemeenschappelijk Fonds heeft mogelijkheden gecreëerd voor academische wetenschappers sonde ontdekking campagnes te starten voor moleculaire targets en signaalwegen die behoefte hebben aan een betere farmacologie 6. De MLPCN biedt onderzoekers toegang tot de industrie-schaal screening centra en medicinale chemie en informatica ondersteuning op laag-moleculaire sondes om de functie van genen en genproducten netwerken toe te lichten te ontwikkelen. De kritische stap in het verkrijgen van toegang tot de MLPCN is de ontwikkeling van een robuuste target-of route-specifieke assay die vatbaar voor high-throughput screening (HTS).
Hier beschrijven we hoe u een fluorescentie gebaseerde thallium (Tl +) flux ASSA ontwikkeleny van Kir kanaalfunctie voor high-throughput screening verbinding 7,8,9,10. De assay is gebaseerd op de permeabiliteit van de K + kanaalporie de K + Tl + congener. Een commercieel verkrijgbare fluorescerende Tl + reporter kleurstof wordt gebruikt flux van Tl + detecteren door de porie. Er zijn minstens drie beschikbare kleurstoffen die geschikt zijn voor Tl + flux assays: BTC, FluoZin-2 en FluxOR 7,8. Dit protocol beschrijft assay-ontwikkeling met behulp FluoZin-2. Hoewel oorspronkelijk ontwikkeld en verkocht als een zink indicator, FluoZin-2 vertoont een robuuste en dosisafhankelijke toename in fluorescentie-emissie bij Tl + binding. We begonnen te werken met FluoZin-2 voor FluxOR beschikbaar was 7,8 en zijn doorgegaan met dat 9,10 doen. De stappen in assay ontwikkeling zijn in wezen identiek voor alle drie kleurstoffen en gebruikers moeten bepalen welke kleurstof meest geschikt is voor de specifieke needs. We bespreken ook de test de prestaties van benchmarks die moeten worden bereikt om in aanmerking komen voor de toegang tot het MLPCN. Sinds Tl + gemakkelijk doordringt de meeste K + kanalen, moet de test kunnen worden aangepast aan de meeste K + kanaal doelstellingen.
Gegevensverwerking: Nadat de gegevens zijn verzameld, een gebruikelijke stap in de analyse omvat normaliseren elke put fluorescentie respons, F, zijn initiële waarde aan het begin van het experiment F 0. Dit wordt gewoonlijk aangeduid als de "statische ratio" en symbool "F / F 0". Wanneer F 0 wordt gedomineerd door de indicatorkleurstof de statische operatie verhouding aanzienlijk zal corrigeren vele factoren zoals disuniformities in verli…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door financiering uit National Institutes of Health subsidies 1R21NS073097-01 en 1R01DK082884 (JSD) en de Stichting voor de National Institutes subsidie PIER11VCTR.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
pcDNA5/TO | Invitrogen | V1033-20 | Tetracycline-inducible expression vector |
T-REx-HEK293 cells | Invitrogen | R71007 | Tetracycline-inducible cell line |
Lipofectamine LTX/Plus Reagent | Invitrogen | 15338100 | Transfection reagent |
FBS | ATLANTA Biologicals | S11550 | Cell culture media |
DMEM | Invitrogen | 11965 | Cell culture media |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | Cell culture media |
Blasticidin S | Invitrogen | R210-01 | Cell culture media |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | Cell culture media |
HBSS-divalent free | Mediatech | 21022CV | Cell washing |
Trypsin-0.25% | Mediatech | 25053CI | Cell dissociation |
Tetracycline-HCl | Sigma | T9823 | Induction reagent |
Dialyzed FBS | ATLANTA Biologicals | S12650 | Plating media |
FluoZin-2 | Invitrogen | F24189 | Fluorescent dye |
Pluronic F-127 | Invitrogen | P-3000MP | Dye loading |
HBSS | Invitrogen | 14175 | Assay buffer |
HEPES | Invitrogen | 15630 | Assay buffer |
NaHCO3 | Sigma | S6297 | Tl+ stimulus buffer |
MgSO4 | Sigma | M2643 | Tl+ stimulus buffer |
CaSO4•2H2O | Sigma | C3771 | Tl+ stimulus buffer |
D-Glucose | Sigma | G7528 | Tl+ stimulus buffer |
Thallium sulfate | Aldrich | 204625 | Tl+ stimulus buffer |
HEPES | Sigma | H4034 | Tl+ stimulus buffer |
DMSO | Sigma | D4540 | Solvent |
Eight-channel electronic pipettor | Biohit | E300 | Cell plating in 384-well plates |
BD PureCoat amine-coated 384-well plates | BD Biosciences | 356719 | Assay microplates |
Echo qualified 384-Well polypropylene microplate (384PP) | Labcyte | P-05525 | Compound source microplates |
384-well polypropylene microplates | Greiner Bio-One | 781280 | |
Multidrop Combi reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
ELx405 microplate washer | BioTek | ELx405HT | Automated cell washing |
Echo liquid handler | Labcyte | Labcyte Echo 550 | |
Bravo automated liquid handling platform | Agilent Technologies | Standard model | |
Hamamatsu FDSS 6000 | Hamamatsu | Kinetic imaging plate reader |
Table 1. List of Materials and Reagents.