High-throughput screening per la piccola molecola modulatori di canali di potassio Inward Rectifier
Summary
Metodi per lo sviluppo e la convalida di un metodo quantitativo di fluorescenza per misurare l'attività di potassio raddrizzatore attivo (Kir) canali di screening ad alto rendimento composto è presentato.
Abstract
Membri specifici della famiglia verso l'interno canale del potassio raddrizzatore (Kir) sono postulato bersagli farmacologici per una varietà di disturbi, tra cui l'ipertensione, fibrillazione atriale, e 1,2 dolore. Per la maggior parte, tuttavia, i progressi verso la comprensione il loro potenziale terapeutico o funzioni fisiologiche anche di base è stata rallentata dalla mancanza di buoni strumenti farmacologici. In effetti, la farmacologia molecolare della famiglia raddrizzatore verso l'interno è rimasta molto indietro quella della superfamiglia S4 del potassio voltaggio-dipendenti (Kv) canali, per i quali un certo numero di nanomolare affinità e altamente modulatori selettivi tossine peptidi sono stati scoperti 3. Il tertiapin veleno d'api tossina e suoi derivati sono potenti inibitori del Kir1.1 e Kir3 canali 4,5, ma peptidi sono di uso limitato terapeuticamente nonché sperimentalmente a causa delle loro proprietà antigeniche e scarsa biodisponibilità, stabilità metabolica e penetranza tessuto. Lo sviluppo di potentie selettivi piccole molecole sonde con migliori proprietà farmacologiche sarà una chiave per comprendere appieno la fisiologia e la potenziale terapeutico dei canali Kir.
La molecolare Biblioteche Sonde Produzione Centro connessioni di rete (MLPCN) supportato dal National Institutes of Health (NIH) Fondo comune ha creato opportunità per gli scienziati accademici di avviare campagne di sonda di rilevamento per target molecolari e vie di segnalazione che hanno bisogno di una migliore farmacologia 6. Il MLPCN fornisce ai ricercatori l'accesso per l'industria scala centri di screening e chimica farmaceutica e informatica sostegno per sviluppare piccole molecole sonde di chiarire la funzione dei geni e delle reti di geni. La fase critica l'ammissione al MLPCN è lo sviluppo di un saggio robusto bersaglio o percorso specifico che è suscettibile di screening ad alto rendimento (HTS).
Qui, descriviamo come sviluppare una fluorescenza a base di tallio (Tl +) flusso assay della funzione Kir canale per screening ad alto rendimento composto 7,8,9,10. Il saggio è basato sulla permeabilità del poro K + canale al K + congenere Tl +. A disponibile in commercio fluorescente Tl + colorante reporter viene utilizzato per rilevare il flusso transmembrana di Tl + attraverso il poro. Ci sono almeno tre coloranti disponibili in commercio che sono adatti per TL + saggi flusso: BTC, FluoZin-2, 7,8 e FluxOR. Questo protocollo descrive lo sviluppo dosaggio con FluoZin-2. Anche se originariamente sviluppati e commercializzati come un indicatore di zinco, FluoZin-2 presenta un incremento robusto e dose-dipendente in emissione di fluorescenza su Tl + vincolante. Abbiamo iniziato a lavorare con FluoZin-2 prima FluxOR era disponibile 7,8 e hanno continuato a farlo 9,10. Tuttavia, le fasi di sviluppo del test sono sostanzialmente identiche per tutti e tre i coloranti, e gli utenti devono determinare quale colorante è più adatto per la loro specifica nresponsabili politici. Discutiamo anche benchmark delle prestazioni del saggio che devono essere raggiunti da considerare per l'ingresso al MLPCN. Poiché Tl + permea facilmente la maggior parte dei canali del K +, il test deve essere adattabile alla maggior parte dei canali K + obiettivi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trattamento: Una volta che i dati sono raccolti, un passo comune consiste nell'analisi normalizzare risposta di fluorescenza di ciascun pozzetto, F, al suo valore iniziale all'inizio dell'esperimento, F 0. Questo è comunemente indicato come "rapporto statico" e simboleggiato "F / F 0". Nei casi in cui è dominato F 0 dal colorante indicatore dell'operazione rapporto statico sarà sostanzialmente per correggere molti fattori…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento del National Institutes of concede Salute 1R21NS073097-01 e 1R01DK082884 (JSD) e Fondazione per il National Institutes concessione PIER11VCTR.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| pcDNA5/TO | Invitrogen | V1033-20 | Tetracycline-inducible expression vector |
| T-REx-HEK293 cells | Invitrogen | R71007 | Tetracycline-inducible cell line |
| Lipofectamine LTX/Plus Reagent | Invitrogen | 15338100 | Transfection reagent |
| FBS | ATLANTA Biologicals | S11550 | Cell culture media |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | Cell culture media |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | Cell culture media |
| Blasticidin S | Invitrogen | R210-01 | Cell culture media |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | Cell culture media |
| HBSS-divalent free | Mediatech | 21022CV | Cell washing |
| Trypsin-0.25% | Mediatech | 25053CI | Cell dissociation |
| Tetracycline-HCl | Sigma | T9823 | Induction reagent |
| Dialyzed FBS | ATLANTA Biologicals | S12650 | Plating media |
| FluoZin-2 | Invitrogen | F24189 | Fluorescent dye |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P-3000MP | Dye loading |
| HBSS | Invitrogen | 14175 | Assay buffer |
| HEPES | Invitrogen | 15630 | Assay buffer |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | Tl+ stimulus buffer |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | Tl+ stimulus buffer |
| CaSO4•2H2O | Sigma | C3771 | Tl+ stimulus buffer |
| D-Glucose | Sigma | G7528 | Tl+ stimulus buffer |
| Thallium sulfate | Aldrich | 204625 | Tl+ stimulus buffer |
| HEPES | Sigma | H4034 | Tl+ stimulus buffer |
| DMSO | Sigma | D4540 | Solvent |
| Eight-channel electronic pipettor | Biohit | E300 | Cell plating in 384-well plates |
| BD PureCoat amine-coated 384-well plates | BD Biosciences | 356719 | Assay microplates |
| Echo qualified 384-Well polypropylene microplate (384PP) | Labcyte | P-05525 | Compound source microplates |
| 384-well polypropylene microplates | Greiner Bio-One | 781280 | |
| Multidrop Combi reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| ELx405 microplate washer | BioTek | ELx405HT | Automated cell washing |
| Echo liquid handler | Labcyte | Labcyte Echo 550 | |
| Bravo automated liquid handling platform | Agilent Technologies | Standard model | |
| Hamamatsu FDSS 6000 | Hamamatsu | Kinetic imaging plate reader |
Table 1. List of Materials and Reagents.
References
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