안쪽 정류기의 칼륨 채널의 소형 분자 변조기에 대한 높은 처리량 검사
Summary
안쪽 정류기의 칼륨 (Kir) 높은 처리량 화합물 심사에 대한 채널의 활동을 측정하기위한 양적 형광 분석을 개발하고 검증하기위한 방법이 제공됩니다.
Abstract
안쪽 정류기의 칼륨 (Kir) 채널 가족의 특정 구성원은 고혈압, 심방 세동과 통증 1,2 등의 질환의 다양한에 대한 약물 목표를 postulated 있습니다. 대부분의 경우, 그러나, 자신의 치료 가능성이나 기본적인 생리 기능을 이해하는 방향으로 진행 좋은 약리 도구의 부족에 의해 느려졌습니다. 사실, 안쪽 정류기 제품군의 분자 약리학 훨씬 nanomolar 화성과 매우 선택적 펩타이드 독소의 변조기의 번호가 3 발견되었습니다 된 전압 개폐 칼륨 (KV) 채널의 S4 superfamily의 뒤에 느껴지있다. 벌 독이 독소의 tertiapin 및 파생 4,5 Kir1.1와 Kir3 채널의 강력한 억제제하지만, 펩티드는 실험적으로 therapeutically뿐만 아니라 제한된 용도의 antigenic 속성과 가난한 생체 이용률, 신진 대사 안정성과 조직 penetrance로 인해 수 있습니다. 강력한 개발향상된 약리 특성을 가진 선택적 작은 분자 프로브는 완전히 생리학과 Kir 채널 치료 가능성을 이해하는 열쇠가 될 것이다.
학술 과학자들은 더 나은 약리학 6 필요로하는 분자 표적 및 신호 전달 경로에 대한 프로브 발견 캠페인을 시작하기 위해 국립 보건원에서 지원하는 분자 도서관 프로브 제작 센터 네트워크 (MLPCN (주) NIH) 공통 기금은 기회를 만들었습니다. MLPCN는 연구자에게 산업 규모 검진 센터, 의약 화학, 정보학은 유전자와 유전자 네트워크의 기능을 명료하게하다하는 작은 분자 프로브를 개발 지원에 대한 액세스를 제공합니다. MLPCN에 항목을 얻을의 중요한 단계는 높은 처리량 검사 (HTS)에 대한 의무입니다 강력한 대상 또는 경로 별 분석의 개발입니다.
여기, 우리는 형광 기반의 탈륨 (TL +) 자속 assa을 개발하는 방법에 대해 설명합니다높은 처리량 화합물 심사 7,8,9,10에 대한 Kir 채널 기능의 y는. 분석은 K의 투자율 + K + congener TL +에 채널 기공을 기반으로합니다. 상업적으로 이용 가능한 형광 TL + 기자 염료가 모공을 통해 TL의 transmembrane 유량을 + 감지하는 데 사용됩니다. BTC, FluoZin-2 및 FluxOR 7,8 : TL + 자속 assays에 적합 적어도 세 상업적으로 이용 가능한 염료가 있습니다. 이 프로토콜은 FluoZin-2를 사용하여 분석 개발에 대해 설명합니다. 원래 개발 및 아연 표시로 판매했지만, FluoZin-2 전시 TL시 형광 방출 + 바인딩에 강력하고 복용 종속적 인 증가합니다. 우리는 FluxOR는 7,8 사용할 수 등 9,10 할 계속하기 전에 FluoZin-2와 협력하기 시작했습니다. 그러나, 분석 개발 단계는 세 염료에 본질적으로 동일하며, 사용자는 자신의 특정 N에 가장 적합한 어떤 염료 확인해야합니다eeds. 우리는 또한 MLPCN에 항목으로 간주 할 수에 도달해야합니다 검정의 성능 벤치 마크에 대해 설명합니다. TL +는 쉽게 대부분의 K + 채널을 permeates 때문에, 분석은 대부분의 K + 채널 대상에 적용해야합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
데이터 치료 : 일단 데이터가 분석에 일반적인 단계는 실험, F 0 초에 초기 값으로 각도의 형광 반응, F를 정규화, 포함한다 수집하고 있습니다. 이것은 일반적으로 "정적 비율"로 지칭하고 "F / F 0"상징합니다. F 0 표시기 염료에 의해 지배되는 경우에는 정적 비율 작업이 실질적으로 같은 조명, 신호 컬렉션에 disuniformities 등 여러 요인…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강 보조금 1R21NS073097-01과 1R01DK082884 (JSD)과 국립 연구소 부여 PIER11VCTR에 대한 재단의 국립 연구소에서 자금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| pcDNA5/TO | Invitrogen | V1033-20 | Tetracycline-inducible expression vector |
| T-REx-HEK293 cells | Invitrogen | R71007 | Tetracycline-inducible cell line |
| Lipofectamine LTX/Plus Reagent | Invitrogen | 15338100 | Transfection reagent |
| FBS | ATLANTA Biologicals | S11550 | Cell culture media |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | Cell culture media |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | Cell culture media |
| Blasticidin S | Invitrogen | R210-01 | Cell culture media |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | Cell culture media |
| HBSS-divalent free | Mediatech | 21022CV | Cell washing |
| Trypsin-0.25% | Mediatech | 25053CI | Cell dissociation |
| Tetracycline-HCl | Sigma | T9823 | Induction reagent |
| Dialyzed FBS | ATLANTA Biologicals | S12650 | Plating media |
| FluoZin-2 | Invitrogen | F24189 | Fluorescent dye |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P-3000MP | Dye loading |
| HBSS | Invitrogen | 14175 | Assay buffer |
| HEPES | Invitrogen | 15630 | Assay buffer |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | Tl+ stimulus buffer |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | Tl+ stimulus buffer |
| CaSO4•2H2O | Sigma | C3771 | Tl+ stimulus buffer |
| D-Glucose | Sigma | G7528 | Tl+ stimulus buffer |
| Thallium sulfate | Aldrich | 204625 | Tl+ stimulus buffer |
| HEPES | Sigma | H4034 | Tl+ stimulus buffer |
| DMSO | Sigma | D4540 | Solvent |
| Eight-channel electronic pipettor | Biohit | E300 | Cell plating in 384-well plates |
| BD PureCoat amine-coated 384-well plates | BD Biosciences | 356719 | Assay microplates |
| Echo qualified 384-Well polypropylene microplate (384PP) | Labcyte | P-05525 | Compound source microplates |
| 384-well polypropylene microplates | Greiner Bio-One | 781280 | |
| Multidrop Combi reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| ELx405 microplate washer | BioTek | ELx405HT | Automated cell washing |
| Echo liquid handler | Labcyte | Labcyte Echo 550 | |
| Bravo automated liquid handling platform | Agilent Technologies | Standard model | |
| Hamamatsu FDSS 6000 | Hamamatsu | Kinetic imaging plate reader |
Table 1. List of Materials and Reagents.
References
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