Os métodos para o desenvolvimento e validação de um ensaio quantitativo de fluorescência para medir a actividade de potássio rectificador de entrada (Kir) canais de rastreio de alto rendimento composto é apresentado.
Membros específicos da família retificador de potássio para o interior do canal (Kir) são postuladas alvos terapêuticos para uma variedade de doenças, incluindo a hipertensão, a fibrilação atrial, e de 1,2 a dor. Para a maior parte, no entanto, os avanços na compreensão do seu potencial terapêutico, ou mesmo funções fisiológicas básicas foi retardado pela falta de boas ferramentas farmacológicas. Na verdade, a farmacologia molecular da família rectificador de entrada tem ficado muito aquém do da superfamília S4 de potássio dependentes da voltagem (Kv) canais, para o qual um número de afinidade nanomolar e moduladores de toxinas peptídicas altamente selectivos foram descobertos 3. A toxina de veneno de abelha tertiapin e seus derivados são inibidores potentes da Kir1.1 Kir3 e canais de 4,5, mas os péptidos são de uso limitado terapeuticamente bem como experimentalmente devido às suas propriedades antigénicas e de biodisponibilidade pobre, a estabilidade metabólica e a penetrância do tecido. O desenvolvimento de potentese selectivos de pequenas moléculas sondas com propriedades farmacológicas melhoradas será a chave para a plena compreensão da fisiologia e potencial terapêutico de canais Kir.
O Molecular Libraries Sondas de Produção Centro de Rede (MLPCN), apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) Fundo Comum criou oportunidades para os cientistas acadêmicos para iniciar campanhas de sonda de detecção de alvos moleculares e vias de sinalização que necessitam de melhor farmacologia 6. O MLPCN fornece aos pesquisadores acesso aos centros de indústria em escala de triagem e química medicinal e informática de apoio para desenvolver moléculas pequenas sondas para elucidar a função dos genes e redes de genes. O passo crítico para a admissão ao MLPCN é o desenvolvimento de um ensaio de meta-ou via específica robusto que é tratável através de rastreio de alto rendimento (HTS).
Aqui, descrevemos como desenvolver uma fluorescência baseada em tálio (Tl +) fluxo assay de Kir função do canal de rastreio de alto rendimento composto 7,8,9,10. O ensaio é baseado sobre a permeabilidade do canal de K + de poro para o composto aparentado + K + Tl. A comercialmente disponível fluorescente Tl + corante repórter é utilizado para detectar o fluxo transmembranar de Tl + através do poro. Existem pelo menos três corantes disponíveis comercialmente que são adequados para os ensaios de fluxo de Tl +: BTC, FluoZin-2, e FluxOR 7,8. Este protocolo descreve o desenvolvimento do ensaio usando FluoZin-2. Embora originalmente desenvolvidos e comercializados como um indicador de zinco, FluoZin-2 apresenta um aumento robusto e dose-dependente, na emissão de fluorescência após a ligação Tl +. Começamos a trabalhar com FluoZin-2 antes FluxOR estava disponível 7,8 e continuaram a fazê-lo 9,10. No entanto, os passos no desenvolvimento do ensaio são essencialmente idênticas para todas as três corantes, e os utilizadores devem determinar quais corante é mais apropriada para o seu n específicoeeds. Discutimos, também, referência do ensaio de desempenho que devem ser alcançados a ser considerado para a entrada no MLPCN. Desde Tl + facilmente permeia a maioria dos canais de K +, o ensaio deve ser adaptável para a maioria dos objectivos de K + channel.
Tratamento de dados: Uma vez que os dados são recolhidos, um passo comum na análise envolve a normalizar resposta da fluorescência de cada poço, F, ao seu valor inicial no início da experiência, F 0. Isto é vulgarmente referido como o "índice estático" e simbolizado "F / F 0". Nos casos em que F 0 é dominado pelo corante indicador de operação estática proporção substancialmente corrigir por muitos factores tais como desunifor…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi suportado por financiamento do Instituto Nacional de Saúde concede 1R21NS073097-01 e 1R01DK082884 (JSD) e Fundação para o National Institutes concessão PIER11VCTR.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
pcDNA5/TO | Invitrogen | V1033-20 | Tetracycline-inducible expression vector |
T-REx-HEK293 cells | Invitrogen | R71007 | Tetracycline-inducible cell line |
Lipofectamine LTX/Plus Reagent | Invitrogen | 15338100 | Transfection reagent |
FBS | ATLANTA Biologicals | S11550 | Cell culture media |
DMEM | Invitrogen | 11965 | Cell culture media |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | Cell culture media |
Blasticidin S | Invitrogen | R210-01 | Cell culture media |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | Cell culture media |
HBSS-divalent free | Mediatech | 21022CV | Cell washing |
Trypsin-0.25% | Mediatech | 25053CI | Cell dissociation |
Tetracycline-HCl | Sigma | T9823 | Induction reagent |
Dialyzed FBS | ATLANTA Biologicals | S12650 | Plating media |
FluoZin-2 | Invitrogen | F24189 | Fluorescent dye |
Pluronic F-127 | Invitrogen | P-3000MP | Dye loading |
HBSS | Invitrogen | 14175 | Assay buffer |
HEPES | Invitrogen | 15630 | Assay buffer |
NaHCO3 | Sigma | S6297 | Tl+ stimulus buffer |
MgSO4 | Sigma | M2643 | Tl+ stimulus buffer |
CaSO4•2H2O | Sigma | C3771 | Tl+ stimulus buffer |
D-Glucose | Sigma | G7528 | Tl+ stimulus buffer |
Thallium sulfate | Aldrich | 204625 | Tl+ stimulus buffer |
HEPES | Sigma | H4034 | Tl+ stimulus buffer |
DMSO | Sigma | D4540 | Solvent |
Eight-channel electronic pipettor | Biohit | E300 | Cell plating in 384-well plates |
BD PureCoat amine-coated 384-well plates | BD Biosciences | 356719 | Assay microplates |
Echo qualified 384-Well polypropylene microplate (384PP) | Labcyte | P-05525 | Compound source microplates |
384-well polypropylene microplates | Greiner Bio-One | 781280 | |
Multidrop Combi reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
ELx405 microplate washer | BioTek | ELx405HT | Automated cell washing |
Echo liquid handler | Labcyte | Labcyte Echo 550 | |
Bravo automated liquid handling platform | Agilent Technologies | Standard model | |
Hamamatsu FDSS 6000 | Hamamatsu | Kinetic imaging plate reader |
Table 1. List of Materials and Reagents.