ライブセル蛍光顕微鏡を用いた細菌毒素誘導される応答の可視化

Summary

組換え体からコレステロール結合毒素ストレプトリジンOの精製方法

Abstract

細菌毒素は、細胞内容物と外部環境からの物質の流入の漏洩を可能に孔を形成し、膜中のコレステロールと結合する。セルは、アクティブ膜修復プロセスを必要とするこの侮辱から回復、または他の毒素曝露や細胞タイプ¹の量に応じて、死ぬことができます。さらに、これらの毒素は、炎症性サイトカインの配列^2を産生^するマクロファージなどの免疫細胞の活性化を介して感染したホスト内の強い炎症反応を誘導する。多くのグラム陽性菌は、主に特徴づけられていないメカニズムを介してそれらの病原性に寄与することが示されているコレステロール結合毒素を産生する。

これらの毒素に曝露した細胞の形質膜における形態学的変化は本質的な細胞防御を示唆し、細胞外空間に流すことができ、コレステロールに富んだ表面突起、に彼らの隔離を含む機構^3,4。このプロセスは、代謝活性の不在下で、すべてのセルで発生し、化学的固定^4の後にEMを使用して可視化することができる。そのような毒素曝露に応答して炎症を媒介マクロファージなどの免疫細胞は、誘導される膜小胞はIL-1ファミリーのサイトカインを含むことが示唆されており、毒素を流し、これらの炎症性サイトカイン^5,6,7を広めるための両方の責任があるかもしれません。両方とも⁸カスパーゼ1依存プロセスであるとして、IL-1β放出および細胞死の特定の種類の間にリンクと呼ばれるpyroptosisが、示唆されている。膜小胞の毒素結合、脱粒、サイトカイン放出、および潜在的に細胞死を含むこのマクロファージ応答の複雑さを整理するために、我々には、毒素 - 細胞間の相互作用のリアルタイム可視化を可能にラベリング手法や蛍光顕微鏡法を開発した機能不全と死の測定（ 図1）。使用ライブセルイメージングの他の技術の制限のために必要です。フローサイトメトリーは、個々の細胞の高分解能、リアルタイム可視化を提供していないながら、生化学的アプローチは、個々の細胞で発生する効果を解決することはできません。ここで説明する方法は、細胞内の複雑な表現型の変化を伴うその他の刺激によって誘導される応答の動態解析に適用することができます。

Protocol

1。ストレプトリジンO（SLO）の精製

1. 0.5LのLBブロスにプラスミドpBADgIII ^SLOhis-9を含むBL21 GOLDの細胞を20mlの一晩培養物を接種し、500μlの50 mg / mlのアンピシリンを追加します。 37℃で225rpmで振とう培養し、OD ₆₀₀ = 0.6になるまでには、通常1.5時間を〜。 10,000 5分xgで1 mlの細菌（T ₀と見なされます）遠心し、140μlの1×SDSサンプルバッファー/ 1 ODでペレットを溶解し、タンパク質の純度分析用せん断DNAに超音波洗浄します。
2. 文化〜5mlの20％のアラビノースを添加して細菌を誘導し、3時間室温で225rpmで振とうする。細菌の1ミリリットルを収集し、純度分析用のT ₃の時点について、上記の1×SDSサンプルバッファーで遠心し、溶解する。
3. 500mlの遠心ボトルに残っている細菌を収集し、4℃（8500回転ソーバルGS-3ローター）で12分間、12,000×gで遠心する。必要であれば℃で一晩以上-80℃で上清、店舗ペレットをデカントします。
4. frを再懸濁400μlの25パーセントのトリトンX-100、100μlの100 mg / mlのリゾチーム、50で補足10ミリリットル/洗浄溶解緩衝液（50mMのNaH ₂ PO _4、300mMのNaCl、10mMイミダゾール、pH8.0）中で氷上ozenペレットμlの200 mMのフッ化フェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）。 50ミリリットルオークリッジ管に再懸濁ペレットを転送します。
5. 30秒間隔で、氷上で30秒間5回ライセートを超音波洗浄します。スピンは4℃（18,000 rpmのソーバルSS-34ローター）で20分間39000×gでオークリッジ管で溶解液を超音波処理した。
6. ライセートが回転しているときに、4℃で5分間1200 rpmで洗う/溶解バッファーとスピン10mlで1ミリリットルNi-NTAアガロースを洗浄℃に（それ以降のすべての洗浄/溶出は、これらの条件下で遠心分離を使用します）。洗浄を吸引します。
7. ステップ1.5からNi-NTAアガロースに細菌の上清を追加し、4℃で2.5時間穏やかに振とう℃、上清を回収するためにスピン。 10μ4X SDSサンプルバッファーで上清30μlを組み合わせると純度分析のために保存。洗浄/溶解緩衝液中で、オンビーズを4回洗うトリス/塩緩衝液（50mM Tris、300mMのNaCl、pH8.0）にCE。
8. 、ビーズに1 mlの溶出バッファー（トリス/塩緩衝液中の250mMイミダゾール）および5μlの1Mのジチオスレイトール（DTT）を添加すること、氷上で10分間インキュベートし、紡績、上清を収集することにより、3回溶出する。 SLOは非常にレドックス感受性タンパク質であり、常に氷上に維持しなければなりません。でも、時間の短い期間に、37℃に加温した場合、一度減少し、タンパク質は急速にその活性を失うことになる。
9. 溶出緩衝液で500μlのポリミキシン共役アガロース、4℃で1分を500μlのCを再懸濁し、10,000 xgでスピンを洗う。エンドトキシンを枯渇させるために、それぞれの溶出に200μlのビーズを追加して、30分間、4℃を振る。 1 4時分℃、上清を保存し、10,000 xgでスピン。 SDS-PAGE解析のために、10μlの4X SDSサンプルバッファーで各溶出液30μlを兼ね備えています。
10. SDS-PAGEによる溶出の純度をテストします。沸騰サンプルは5分間95℃でゲル解析するために保存し、10％ゲルで10μlをロードします。 GEを染色蛋白質を可視化するクマシー付きL（ 図2A）。 SLOは69 kDaである。 （典型的な収率は、最初の2つの溶出のために4 mg / mlのですが、使用する細菌株およびプラスミドによって異なる場合があります）タンパク質濃度を決定するために、ブラッドフォードアッセイを行う。
11. それぞれの溶出の溶血活性をテストします（下記参照）。純度、濃度、溶血活性が良好であるプールの溶出。シングルユースのアリコート（通常5〜10μL）にアリコートSLOは、-80℃でドライアイスと℃で保存時にフリーズ

2。溶血アッセイ

1. RBCアッセイ緩衝液（0.3％ウシ血清アルブミン（BSA）、2mMのCaCl _2、10mMのHepes、pH7.4）で5分間1200 rpmでスピンでヒツジ赤血球（RBC）を洗浄し、2.5％の赤血球における懸濁する10ミリリットルのRBCアッセイバッファー。
2. /ウェル氷上で96ウェルV底プレートに10μlのRBCのアッセイバッファーを追加します。直列二連で各溶出を薄める。典型的な希釈範囲は1:512,000に1:1000である。 10でない毒素を持つ3つのウェルと3つのウェルを含むそれぞれ、最小と最大の井戸としてTriton X-100を2パーセントずつ。
3. 37℃で30分間インキュベートし、プレートをカバーしています。 5分間1,200 rpmで遠心分離します。平底96ウェルプレートに上清70μlを。 _405を読ん_でください。 1単位は、RBCの50％溶解するために必要な毒素の希釈である。毒素活性を1ユニット*希釈factor/0.01 mlである。

3。細胞溶解アッセイ

1. 細胞を回収し、カウント、スピン。 2×10 ⁶バッファR / B（2mMのCaCl ₂を含むRPMI、0.5％BSA）および20μg/ mlのヨウ化プロピジウムで/ mlで再懸濁する。 96ウェルV底プレートに100μlの細胞を追加します。
2. シリアルバッファR / Bで最終濃度が2倍にSLOを希釈し、細胞に100μlの毒素または100μlバッファR / Bを追加します。 5分間37℃でインキュベートするU / mlの2000から31.25 U / mlの最終濃度に典型的な範囲です。
3. フローサイトメーター上でセルを実行し、フィコエリトリン（PE）のためのフィルタを使用してデータを収集します。 1ログシフトは一過透過処理セルを表しますLS 3ログシフトは死んだ細胞^4を示している。次のように、実験（％PIの^高い _EXP）からの制御で死んだ細胞の割合（％PIの^高い _CTL）を差し引くことにより、細胞の特異的溶解を計算する：特異的溶解=（％PIの^高い _EXP - ％PIの^高い _CTL） /（100 - ％PIの^高い _CTL）* 100

4。培養皿で細胞への毒素のマイクロピペットデリバリー

1. コラーゲンコートガラスボトム35mmディッシュの実験は、プレート^{2×10 5}のマクロファージへの1日前。
2. 顕微鏡やマイクロインジェクターをオンにします。加熱ステージ時間は37℃に温め許可顕微鏡の選択は、通常、ローカルで使用可能であるかに依存します。顕微鏡は、倒立ステージ37に選ばれた染料と、物理的に微量注入器を接続するためのスペースに適し℃、励起/蛍光フィルターキューブを皿を加熱することができる段階を必要とします。バートランドレンズマイクロインジェクションのために役立ちますが、必須ではありません。顕微鏡を駆動するコンピュータは、データを収集し、保存するための十分なメモリが必要です。
3. 37℃染料で30分間標識細胞℃、アッセイに応じて、標識は、1ミリリットルのフルメディアにAM 1 mlのPBSまたは2μlのカルセインで午前5μlのFura2で行うことができる。 Fura2は、励起/発光は510分の340 nmと510分の380 nmのために収集され、380分の340の信号の比は、カルシウムフラックスを決定します。エチジウムホモは620分の525 nmで、APCは660分の650 nmである一方カルセインは、励起/発光は515分の495 nmである。他のラベルも同様に選択することができる。
4. 2mMのCaCl ₂を補充した1ミリリットルRPMIにPBSおよび場所で細胞を洗浄。顕微鏡にマウントします。
5. 4℃、20,000×gで10分で毒素およびデキストラン水中で、遠心分離を薄める典型的には、1μlのSLOと4μlの10 mg / mlのデキストラン-555は6μlの水で希釈する。デキストランまたは別の蛍光液相分子は、フェムト先端が詰まっていないことを確認するために使用されており、麟蹄CTSは、必要に応じて。
6. microloaderを使用して希釈された毒素の0.07μlの背面からフェムト先端をロードします。
7. マイクロインジェクターにフェムト先端をロードします。先端はすべての方向に移動する部屋を有する細胞の中心上に座りますようにインジェクタの角度を調整します。 z軸の制限をクリアします。注入の設定は20psiの背圧は120 psiで0.5秒間注入する必要があります。それは、媒体に入るまで先端を下げる。
8. バートランドレンズ、中央先端を使用して、それを細胞に近い下げられるように先端に従ってください。一度フォーカスを失い、通常の光学系に切り替えます。針の影は、フィールドには明らかであろう。セルの上でピントを合わせ、それが焦点になるまで、ニードルを下げてください。細胞上にバックフォーカスと慎重にセルに隣接する針を持参。注射用のz-limitを設定します。所望の位置に先端を移動し、撮影を開始し、所望の時点で毒素を解放するために注入する。針を上げ、細胞の新しい領域に移動して注入します。望ましくないことを防止するためにホームポジションに針を動かす針から毒素漏れ。

Representative Results

典型的には10 ^{7〜10 8} U / mlのSLOは4 mg / mlのタンパク質濃度を求めることができる。細胞溶解に必要な毒素の量は、細胞の種類によって異なりますが、通常125から500 U / mlのSLO（ 図2B）です。他人（特にT細胞株）は、より敏感であるけれどもマクロファージ様細胞型（4000 U / ml）を、より耐性があることができます。これらの感応度は市販のSLOに対応しています。毒素活性は、各凍結融解とほぼ2倍に減少し、毒素の各バッチまたは融解による溶血アッセイは毒素活性を確認するために必要とされるようにします。毒素は、タンパク質を扱う際には注意が必要ですので、コレステロール含有膜の非存在下でも熱や酸化¹⁰に非常に敏感です。

毒素のマイクロデリバリーは、同じ皿の中で毒素を処理した細胞と未処理細胞の比較が可能になります。拡散勾配が確立されますので、それも、毒素活性に内部統制を提供していますマイクロピペットの先端から設置しました。近いマイクロピペットへの領域は、細胞死が表示され、さらにアウェイチップからの領域は全く損傷（ 図3）は表示されません一方、カルセインの損失およびエチジウムホモ二量体の取り込みに代表される。先端がフィールド（ 図3）に沿って移動させるとして使わ毒素の効力を与えられても、背圧の存在下でマイクロピペットから漏れる少量の細胞を破壊することができる。マイクロインジェクターで安全性のオプションを使用すると、この損失を避けることができます。

毒素のマイクロデリバリーはまた、カルシウムフラックスなどのリアルタイム·イベント、（ 図4）の試験を可能にします。このフラックスは、固定した細胞で観察され、毒素の局所送達は、この誘導されたカルシウムフラックスは細胞培養を介して伝播される方法の研究を可能にすることはできません。これはまた、カルシウムフラックス^11を誘導^すること^ができるようにケアは、マイクロピペット自体で細胞を傷つけないよう注意しなければなりません。

加えて標準の広視野顕微鏡に、マイクロデリバリーを高速3D共焦点顕微鏡と組み合わせることができます。広いフィールド上に共焦点顕微鏡の利点は、z次元でのイベントを解決し、個々の面を分析する能力である。現在の技術では、回転するディスク共焦点の使用が必要とされる高速性を達成するために必要である。これらの利点は、毒素注射（ 図5）に続いて、樹状細胞から放出される微粒子の可視化を可能にします。これらの微粒子は、細胞修復プロセス⁴の一部として流されています。毒素分子は⁴毒素^を排除するために放出されるブレブ、に集中している。共焦点イメージングせず、微粒子を検出することは困難であろうし、潜在的に毒素がこのように除去されないという結論につながる。

図1：全体ライブセルイメージングの毒素を生成して利用するためのワークフロー。毒素を精製し、厳格な品質管理を行い、その後、以前に表面タンパク質に生存能力染料、カルシウム指示薬または抗体で標識された細胞にマイクロピペットを介して配信されます。データは、顕微鏡で取得し、その後そのようなMetamorphまたは要素として、ソフトウェアを用いて解析する。

図2精製SLOの品質管理。 （A）は細菌の検体を測定する前に、（T _0）と後（T _3）毒素誘導、上清を以下の精製（S）、および3溶出_{（E1〜E3）}の各々は、クーマシーブルーで、SDS-PAGEとステンドによって解決されました。 （B）のどちらか樹状細胞ラインD2または白血病細胞株T27Aは、プロピジウムヨウ化物の存在下で37℃で5分間SLOの様々な濃度でチャレンジしたフローサイトメトリーによって調べた。 - /（100 - ％PIの^高い _CTL）* 100特異的溶解=（％PIの^高い _CTL％PI ^高い _EXP）：特異的溶解は、以下の式により決定された

図3：カルセイン信号および細菌毒素anthrolysin Oの線維芽細胞への局所曝露後のヒト皮膚線維芽細胞におけるEtBrを取り込みの消失によって示さ細胞死はLife Technologies社からのライブデッドキットを使用してカルセインAMおよびエチジウムホモダイマーとインキュベートした。コレステロール結合毒素anthrolysin O ^13（リチャード·レスト、ドレクセル大学からの贈り物）の100 pgが培養皿の中央にマイクロピペットで配信され、広視野蛍光画像は、30分後に40倍の対物レンズを用いて収集した。複数のフィールドからの画像は、Metを用いて示されて拡大画像を生成するために結合されたamorph。

図4：細菌毒素のSLOに暴露したヒト樹状細胞の細胞質へのカルシウム流入。細胞はfura2を充填した80 U /μlの濃度でSLOのソリューションの配信と1 NL / minの流量で前にAM。配信に使用されるマイクロピペットの先端が黄色のアスタリスクによって、時間0で示されている。画像は、340および380 nmの励起波長で広視野モードで連続的に採取し、細胞質カルシウム濃度を決定するために使用される排出量の比率た。緑から青擬似カラーへのシフトは、細胞質カルシウム濃度の増加を示しています。各パネルのタイムマークは、毒素の添加を開始した後に秒数を示します。スケールバーは20μmである。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

図5 SLOにさらさ樹状細胞の表面から微小胞のリリース。細胞は、SLOの3×10 ^-3 Uのボーラスの配信に続いて、原形質膜を標識するためにAPCへの抗CD11c共役と共にプレインキュベートした。 3次元再構成は、分単位で示され、各時点で収集された共焦点Z-スタックから生成されていました。微量注入器の先端は、DICイメージングを使用して同定され、黄色の矢印で示されます。スケールバーは20μmである。

Discussion

技術は細菌毒素に対する免疫細胞の反応の検査を可能にする、ここで説明。最も重要なステップは、毒素の取り扱いと投薬です。毒素活性はさらにそのもろさのために、同じ製剤の異なるアリコートの間、非常に可変にすることができます。これは、いずれかの基準セルラインや赤血球に対する毒素の各アリコートをテストする、または毒素のグラデーションを使用する必要が生じて。毒素勾配は、マイクロピペットなどで配信、リアルタイムで観察することが毒素による活動の完全なスペクトルを許可しますが、生化学的な解析には向いていません。

毒素のマイクロピペットの配信が困難な場合があります。標準のマイクロインジェクションとは異なり、細胞の浸透は、このアッセイでは必要ありません。実際には、注意が、これは似たような膜修復応答^12を引き出すだろうとして、針自体で細胞を傷つけないように注意しなければなりません。免疫細胞では、特に、カルシウムフラックスはによって生成された針の接触は文化¹¹内の他のセルにカーボンナノチューブを介して伝播する。注入していない細胞はまた、針の寿命を延長します。同様に、細胞への針の下降に追従するバートランドレンズの使用は、マイクロピペットの位置決めにおけるいくつかの不確実性を除去します。破損した針をそのまま針よりも急速に毒素をリークしますが、それらはまだ予備的な結果を生成するために使用することができる。マイクロインジェクターシステムは、より高い毒素勾配は望まれるべきであり、複数回の注射が可能になります。あるいは、噴射期間は納入用量を変更するために変更することができます。微量注入器は、複数の実験が一皿内で実行することができます。また、再投与の効果を検討することができます。我々は免疫細胞を調べる実験を説明しているが、これらのメソッドは、他の細胞系に適合させることができた。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ni-NTA agarose	Qiagen	30210
polymixin-agarose	Sigma	P1411-5ML
Zeba Desalt Spin col	Fisher	PI-89891
sheep RBCs	Fisher	50-415-688
pBADgIII-SLO	N/A	N/A	see ref9
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA25001
Fura2-AM	Life Technologies	F1221
Calcein AM/ Ethidium homodimer	Life Technologies	L3224
Anti-CD11c-APC	BD Biosciences	550261
collagen-coated glass-bottom dish	Mattek	P35GCol-1.5-10-C
femto-tip II	Fisher	E5242957000
Microloader	Fisher	E5242956003
dextran Alexa 555	Life Technologies	D34679
Injectman NI 2	Eppendorf	920000029
FemtoJet	Eppendorf	5247 000.013
Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed.
Buffer Composition Step Used Lyse/Wash 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM imidazole, pH 8.0 1.4 Tris/salt 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 1.7 Elution buffer 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 250 mM imidazole 1.8 RBC Assay buffer 0.3% BSA 2 mM CaCl2 10 mM HEPES, pH 7.4 2.1 buffer R/B RPMI cell culture medium 2 mM CaCl2 0.5% BSA 3.1
Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed.