استخدام الخلايا الليفية الإنسان الأساسية لرصد نمط ظاهري الميتوكوندريا في مجال مرض باركنسون
Summary
الخلايا الليفية من المرضى تحمل طفرات في الجينات المسببة للمرض باركنسون يمثل الوصول إليها بسهولة<em> خارج الجسم</em> نموذج لدراسة الظواهر المرتبطة المرض. يعيش خلية التصوير يعطي فرصة لدراسة الصفات المورفولوجية والوظيفية في الخلايا الحية. نحن هنا وصف إعداد الخلايا الليفية الإنسان ورصد الظواهر اللاحقة من الميتوكوندريا.
Abstract
مرض باركنسون (PD) هو الثاني الأكثر شيوعا اضطراب الحركة ويصيب 1٪ من الناس فوق سن ال 60 1. لأن الشيخوخة هي عامل خطر الأهم من ذلك، سوف زيادة حالات PD خلال العقود القادمة 2. بجوار طي البروتين المرضية وضعف مسارات تدهور البروتين، وأشار في وظيفة الميتوكوندريا التعديلات والتشكل على النحو السمة المميزة مزيد من تنكس عصبي في PD 3-11.
بعد سنوات من البحث في الخلايا السرطانية الفئران والإنسان ونماذج في المختبر لتشريح المسارات الجزيئية بمرض باركنسونز، أصبح استخدام الخلايا الليفية الإنسان من المرضى وضوابط ملائمة كنماذج فيفو السابقين أداة بحث قيمة، إذا أخذت في الاعتبار المحاذير المحتملة. غير خلد، ونماذج خلية اصطناعية بدلا من ذلك، الخلايا الليفية الأولية من المرضى تحمل المرض الطفرات المرتبطة تعكس على ما يبدو الميزات الهامة المرضية ياو هذا المرض الإنسان.
نحن هنا تحدد الإجراء أخذ خزعات الجلد، الخلايا الليفية الإنسان وزراعة باستخدام بروتوكولات مفصلة لتقنيات المجهرية ضرورية لتحديد الظواهر الميتوكوندريا. واستخدمت هذه الميزات للتحقيق المختلفة المرتبطة PD ذات الصلة وظيفة الميتوكوندريا وديناميكية. فيفو السابقين، يمكن تحليل الميتوكوندريا من حيث وظيفتها، مورفولوجيا، colocalization مع الجسيمات الحالة (الميتوكوندريا المختلة وظيفيا والعضيات المهينة) وتدهور عبر مسار الليزوزومية . هذه الظواهر هي ذات أهمية كبيرة للتعرف على العلامات المبكرة للPD قد يسبق الأعراض السريرية للسيارات في ناقلات للأمراض الجينات البشرية. وبالتالي، يمكن الاستفادة من المقايسات المقدمة هنا كأدوات قيمة للتعرف على الميزات المرضية من تنكس عصبي ويساعد على تحديد استراتيجيات علاجية جديدة في PD.
Protocol
Discussion
الخلايا الليفية الجلد المريض كنماذج فيفو السابقين تمثل أداة مهمة لوصف المرض المرتبطة عيوب وراثية. وبالإضافة إلى ذلك، والجلد المستمدة من الخلايا الليفية يمكن الحصول عليها بسهولة ويمكن توسيعها عند زراعة. ولذلك، الخلايا الأولية التي تم الحصول عليها من المرضى تحم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة فريتس تيسن (10.11.2.153 إلى RK)، ومجلس البحوث الألمانية (DFG، وKR2119/3-2 KR2119/8-1 إلى RK)، والوزارة الاتحادية للتعليم والبحث (BMBF ، NGFNplus؛ 01GS08134 إلى RK) ومنحة دراسية من مؤسسة الدكتوراه هرتي الخيرية [لLFB]. نشكر كارولين OBERMAIER وWestermeier جوليا لما قدموه من دعم خلال تبادل لاطلاق النار الفيديو.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue no. |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Invitrogen | 52400-025 |
| RPMI 1640 medium, no Phenol Red | Invitrogen | 11835-063 |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Invitrogen | 14190-094 |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | PeproTech | 100-18B |
| AccuMax (detachment solution) | PAA | L11-008 |
| Lab-TekTMII chambered coverglasses | Nalge Nunc International | 115382 |
| Tetramethylrodamine ethyl ester (TMRE) | Invitrogen | T-669 |
| Mitotracker Green FM | Invitrogen | M-7514 |
| Mitotracker CM-H2XRos | Invitrogen | M-7513 |
| Lyostracker Red DND-99 | Invitrogen | L-7528 |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 |
Table 1. Specific reagents and equipment.
References
- de Rijk, M. C., Launer, L. J., Berger, K., Breteler, M. M., Dartigues, J. F., Baldereschi, M., Fratiglioni, L., Lobo, A., Martinez-Lage, J., Trenkwalder, C. Prevalence of Parkinson’s disease in Europe: A collaborative study of population-based cohorts. Neurologic Diseases in the Elderly Research Group. Neurology. 54, 21-23 (2000).
- Dorsey, E. R., Constantinescu, R., Thompson, J. P., Biglan, K. M., Holloway, R. G., Kieburtz, K., Marshall, F. J., Ravina, B. M., Schifitto, G., Siderowf, A. Projected number of people with Parkinson disease in the most populous nations. Neurology. 68, 384-386 (2005).
- Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. Alpha-synuclein in Lewy bodies. Nature. 388, 839-840 (1997).
- Chung, K. K., Zhang, Y., Lim, K. L., Tanaka, Y., Huang, H., Gao, J., Ross, C. A., Dawson, V. L., Dawson, T. M. Parkin ubiquitinates the alpha-synuclein-interacting protein, synphilin-1: implications for Lewy-body formation in Parkinson disease. Nature. 7, 1144-1150 (2001).
- Kruger, R., Eberhardt, O., Riess, O., Schulz, J. B. Parkinson’s disease: one biochemical pathway to fit all genes. Trends Mol. Med. 8, 236-240 (2002).
- Krebiehl, G., Ruckerbauer, S., Burbulla, L. F., Kieper, N., Maurer, B., Waak, J., Wolburg, H., Gizatullina, Z., Gellerich, F. N., Woitalla, D. Reduced basal autophagy and impaired mitochondrial dynamics due to loss of Parkinson’s disease-associated protein DJ-1. PLoS One. 5, e9367 (2010).
- Exner, N., Treske, B., Paquet, D., Holmstrom, K., Schiesling, C., Gispert, S., Carballo-Carbajal, I., Berg, D., Hoepken, H. H., Gasser, T. Loss-of-function of human PINK1 results in mitochondrial pathology and can be rescued by parkin. J. Neurosci. 27, 12413-12418 (2007).
- Burbulla, L. F., Krebiehl, G., Kruger, R. Balance is the challenge–the impact of mitochondrial dynamics in Parkinson’s disease. European journal of clinical investigation. 40, 1048-1060 (2010).
- Strauss, K. M., Martins, L. M., Plun-Favreau, H., Marx, F. P., Kautzmann, S., Berg, D., Gasser, T., Wszolek, Z., Muller, T., Bornemann, A. Loss of function mutations in the gene encoding Omi/HtrA2 in Parkinson’s disease. Human molecular genetics. 14, 2099-2111 (2005).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of cell biology. 183, 795-803 (2008).
- Dagda, R. K., Cherra, S. J., Kulich, S. M., Tandon, A., Park, D., Chu, C. T. Loss of PINK1 function promotes mitophagy through effects on oxidative stress and mitochondrial fission. The Journal of biological chemistry. , 284-13843 (2009).
- Kieper, N., Holmstrom, K. M., Ciceri, D., Fiesel, F. C., Wolburg, H., Ziviani, E., Whitworth, A. J., Martins, L. M., Kahle, P. J., Kruger, R. Modulation of mitochondrial function and morphology by interaction of Omi/HtrA2 with the mitochondrial fusion factor OPA1. Experimental cell research. 316, 1213-1224 (2010).
- Burbulla, L. F., Schelling, C., Kato, H., Rapaport, D., Woitalla, D., Schiesling, C., Schulte, C., Sharma, M., Illig, T., Bauer, P. Dissecting the role of the mitochondrial chaperone mortalin in Parkinson’s disease: functional impact of disease-related variants on mitochondrial homeostasis. Human molecular genetics. 19, 4437-4452 (2010).
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Nguyen, H. N., Byers, B., Cord, B., Shcheglovitov, A., Byrne, J., Gujar, P., Kee, K., Schule, B., Dolmetsch, R. E., Langston, W. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).
- Seibler, P., Graziotto, J., Jeong, H., Simunovic, F., Klein, C., Krainc, D. Mitochondrial Parkin recruitment is impaired in neurons derived from mutant PINK1 induced pluripotent stem cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 5970-5976 (2011).
