3 차원 형광 이미지에서 세포 형태학의 변경 사항 단정 지을 분석 도구
Summary
우리는 단일 세포의 세 차원 공 촛점 형광에서 가져 정의되지 않은 형태의 형태학의 변화를 측정하기 Imaris 신경 과학, ImarisXT 및 MATLAB을 사용하는 소프트웨어 플랫폼을 개발했습니다. 이 새로운 접근 방식은 수용체 활성화에 따라 세포 모양의 변화를 수량화하는 데 사용되므로 약물 발견을위한 가능한 추가 도구를 나타냅니다 할 수 있습니다.
Abstract
형광 이미지를 측정에 사용할 수있는 가장 일반적인 소프트웨어 분석 도구는 데이터 요소 및 분석의 해석 및 결과를 지원하는 컴퓨터 지원 패턴 인식을 포함 및 제외에 대한 수동 설정에 의존 (2D) 2 차원 데이터입니다. 그것은 세포 역학의 복잡성을 캡처 및 생물학적 시스템 내에서 세포 소성의 기초를 이해 할 수하기 위해 (3D) 입체 데이터 세트로 구성 형광 이미지를 측정 할 수 있도록 점점 더 중요 해지고있다. 정교한 현미경 악기는 multispectral 형광 이미지와 다음 수집 된 2D 이미지의 3D 표현을 제공하는 공 촛점 스택에서 이미지를 reconstructs 강력한 분석 소프트웨어의 인수를 통해 3D 형광 이미지의 시각화를 허용하고 있습니다. 고급 디자인 기반 stereology 방법은 origina의 근사와 가정에서 진행 한복잡한 조직 섹션 2 리터 모델을 기반 stereology 1. 현미경에서 이러한 과학적 진보에도 불구하고, 필요 완전히 세포 형태, 단백질 지역화와 수용체 거래의 복잡한 변화의 분석 및 정량화 할 수 있도록하기 위해 고유 3D 데이터를 이용하는 자동화 된 분석 방법으로 남아있다.
형광 이미지를 수량화 할 수 현재 기술은 메타 Morph (분자 장치, 서니 베일, CA) 및 수동 분석을 제공합니다 이미지 J (NIH)가 포함되어 있습니다. Imaris (ANDOR 기술, 벨파스트, 북 아일랜드) 소프트웨어는 볼륨 이미지에 배치하거나 3D 객체를 생성하기 위해 2D 슬라이스 일련의 발행 할 수 있습니다 측정 포인트의 수동 생성을 수있는 기능 MeasurementPro을 제공합니다. 이 방법은 두 객체 사이의 선 거리를 측정하거나 관심있는 지역을 둘러싼 다각형을 만들려면 한 번만 클릭하면 포인트 측정에 유용하지만, compl에 적용하기가 어렵습니다예 셀룰러 네트워크 구조. 필라멘트 추적기 (ANDOR)는하지만,이 모듈은 이러한 수석, axons과 쪽 (구조 나무 등)으로 구성되어 있습니다 뉴런과 같은 정의 구조를 측정하기 위해 개발 된 필라멘트과 같은 3D neuronal 자동으로 감지 할 수 있습니다. 이 모듈은 ingeniously 비 neuronal 세포 3 형태학의 측정을하기 위해 사용되어 왔습니다 그러나, 출력 데이터 오히려 비정질 모양의 휴대폰 모델 것보다 정의 된 셀 모양에 따라 소프트웨어를 사용하여 확장 셀룰러 네트워크의 정보를 제공합니다. 비정질 모양의 세포를 분석하고 생물학적 응용 프로그램 소프트웨어가 더 적합의 문제를 극복하기 위해 Imaris은 Imaris 셀을 개발했다. 이 세포와 세포 기관 사이의 관계를 계산하기 위해 개발 된 Eidgenössische Technische Hochschule과 과학 프로젝트를했습니다. 소프트웨어는 세포 당 하나의 핵을 강요하여, 생물 제약의 검출을 가능하게하는 동안그리고 세그먼트 셀에 셀 멤브레인을 사용하여, 그것은 이상적으로는 무효 공간없이 세포 표면을 구축하기 때문에 연속되지 형광 데이터를 분석하기 위해 이용 될 수 없습니다. 우리의 지식으로, 현재 3D 형광 이미지에서 morphometric 정보를 제공합니다는 사용자가 수정할 수 자동화 접근 방식은 정의되지 않은 형태 (그림 1)의 세포 공간 정보를 달성 개발되지 않았습니다.
우리는 MATLAB (매트 작품 주식회사)에 인터페이스 Imaris 핵심 소프트웨어 모듈 및 Imaris XT를 사용하여 분석 플랫폼을 개발했습니다. 이 도구는 미리 정의 된 모양없이 일관성 형광 네트워크 구성 요소와 세포의 3D 측정을 할 수 있습니다. 또한,이 방법은 세포 역학에 형태학의 변화를 정량화을 수행하는 컴퓨터 응용 프로그램에 익숙 생물 시스템에 전문 지식을 확장하지만,하지 않은 연구자가 허용됩니다.
Protocol
Discussion
우리는 CRF 치료가 중요한 형태의 변화와 CRF-R2의 위치를 유도 것으로 나타났다. CRF-R2의 변경 사항은 선택적 길항제 치료에 의해 저해되었다. 우리는 수용체 수정이 표준 2D multispectral 기술을 사용하여 감지되지 않은 및 측정 할 수없는 것으로 나타났다. 복잡한 3D 이미지를 연구 할 수있는 능력은 morphometric 분석을 위해 생물학적 매개 변수의 복잡성을 반영하는 것이 중요합니다. 우리는 일관성 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 Imaris, Imaris XT와 MATLAB의 사용에 대한 캘리포니아의 생물 이미징 개발 센터 (BIDC) 대학, 샌프란시스코 감사합니다. 우리는 기술 지원 및 헨리, LK Floren, 원고의 편집에 대한 그들의 공헌에 대한 L. Daitch AT V. Kharazia 감사드립니다. 1R21DA029966-01과 약국의 세브 UCSF 학교에 MLSMR 컬렉션을 화면으로 NIH 패스트 트랙 상 (:이 작품은 세브 국립 보건원에 UCSF을 통해 알코올 및 약물 중독에 캘리포니아 의료 연구의 주에서 자금에 의해 지원되었다 딘의 사무실 및 임상 약학)와 CLHK에 의학 대학 (임상 약리학 및 실험 치료학).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Human Embryonic Kidney (HEK293) | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | SH30070.03 | |
| AlexaFluor-488 (IgG2b) | Invitrogen | A-11001 | |
| monoclonal anti-HA.11 (IgG1) | Covance | 16B12 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| CRF | Sigma | C2917 | |
| Antisauvagine-30 (AS-30) | Sigma | A4727 |
References
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