JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Protocol
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

رصد الخلية التي تتمتع بحكم ذاتي إيقاعات الساعة اليومية في التعبير الجيني باستخدام مراسلون ضوء بارد وسيفيراز

Published: September 27, 2012
doi:
10.3791/4234
, , , ,
1Department of Biological Sciences,The University of Memphis

Summary

الساعة البيولوجية تعمل الساعات داخل الخلايا الفردية، أي أنها خلية مستقلة. هنا، نحن تصف طرق لتوليد نماذج على مدار الساعة خلية المستقلة باستخدام غير الغازية، وسيفيراز التكنولوجيا القائمة على تلألؤ بيولوجي في الوقت الحقيقي. خلايا مراسل توفير لين العريكة، ونظم نموذج وظيفي لدراسة علم الأحياء الإيقاعية.

Abstract

في الثدييات، وينظم العديد من جوانب السلوك وعلم وظائف الأعضاء مثل دورات النوم واليقظة والتمثيل الغذائي في الكبد عن طريق الساعات الساعة البيولوجية الداخلية (مراجعة 1،2). والإيقاعية الوقت لحفظ النظام هو الهرمي متعدد مذبذب الشبكة، مع ساعة المركزي الموجود في نواة suprachiasmatic (SCN) مزامنة وتنسيق الساعات خارج SCN والطرفية في أماكن أخرى 1،2. الخلايا الفردية هي وحدات وظيفية للجيل وصيانة إيقاعات الساعة البيولوجية 3،4، وهذه مؤشرات التذبذب من أنواع الأنسجة المختلفة في الكائن الحي على حصة متشابهة بشكل ملحوظ البيوكيميائية آلية تغذية مرتدة سلبي. ومع ذلك، نظرا للتفاعلات على مستوى الشبكة العصبية في SCN ومن خلال العظة، الإيقاعي النظامية على المستوى العضوي، إيقاعات الساعة البيولوجية على المستوى العضوي ليست بالضرورة خلية مستقلة 5-7. دراسات مقارنة للنشاط الحركي التقليدية في الجسم الحي وSCN إإكسبلنتس خارج الجسم، جالذراع التي يوجد مقرها في المقايسات المختبر تسمح لاكتشاف خلية مستقلة العيوب الإيقاعية 5،8. استراتيجيا، خلية النماذج القائمة على أكثر لين العريكة تجريبيا لتوصيف المظهري والاكتشاف السريع للآليات الأساسية على مدار الساعة 5،8-13.

لأن الإيقاع اليومي الحيوية، وهناك حاجة إلى قياسات الطولية العالية لقرار الزمنية لتقييم وظيفة على مدار الساعة. في السنوات الأخيرة، أصبح في الوقت الحقيقي باستخدام تسجيل تلألؤ بيولوجي يراعة luciferase كمراسلة تقنية مشتركة لدراسة الإيقاع اليومي في الثدييات 14،15، لأنه يتيح للفحص لاستمرار وديناميات الجزيئية الإيقاعات. لرصد الخلايا المستقلة إيقاعات الساعة البيولوجية في التعبير الجيني، يمكن عرض صحفيين في الخلايا عن طريق وسيفيراز ترنسفكأيشن عابرة 13،16،17 أو تنبيغ مستقرة 5،10،18،19. نحن هنا وصف بروتوكول تنبيغ مستقرة باستخدام الفيروسة البطيئة بوساطة توصيل الجينات. Tانه نظام ناقلات lentiviral متفوقة على الطرق التقليدية مثل ترنسفكأيشن عابرة وانتقال سلالة الجرثومية بسبب كفاءتها وبراعة: أنه يسمح التنفيذ الفعال والتكامل مستقرة في الجينوم المضيف على حد سواء وعدم تقسيم تقسيم الخلايا 20. مرة واحدة يتم إنشاء خط خلية مراسل، يمكن فحص وظيفة ديناميكية على مدار الساعة من خلال تسجيل تلألؤ بيولوجي. وصفنا لأول مرة جيل من (Per2) P-خطوط مراسل د لوك، ومن ثم تقديم بيانات من هذا وصحفيين الإيقاعية الأخرى. في هذه المقايسات، وتستخدم الخلايا الليفية الماوس 3T3 وU2OS خلايا عظمية الإنسان كنماذج الخلوية. نناقش أيضا سبل مختلفة لاستخدام هذه النماذج على مدار الساعة في الدراسات الإيقاعية. ويمكن تطبيق الأساليب المذكورة هنا لمجموعة كبيرة ومتنوعة من أنواع الخلايا لدراسة أساس الخلوية والجزيئية من الساعات الإيقاعية، وربما تكون مفيدة في معالجة المشاكل في النظم البيولوجية الأخرى.

Protocol

1. بناء مراسلون وسيفيراز Lentiviral A الثدييات بناء مراسل الإيقاعية يحتوي عادة كاسيت التعبير التي تنصهر مع الساعة البيولوجية أحد المروجين الجين وسيفيراز. ويشيع استخدام استراتيجيات ربط كل وإعادة التركيب القائم على استنساخ الحمض ا?…

Discussion

1. تعديلات على البروتوكول الحالي

أجهزة تسجيل 1.1 و اعتبارات الإنتاجية

بسبب توافر التجاري، أصبح LumiCycle (Actimetrics) الأكثر شيوعا جهاز luminometer الآلي في الوقت الحقيقي تسجيل 4،5،9،19،29-31. وتوظف LumiCycle أناب…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل في جزء من المؤسسة الوطنية للعلوم (IOS-0920417) (ACL).

Materials

Name of reagent Company Catalogue number Comments
DMEM HyClone SH30243FS For regular cell growth
DMEM Invitrogen 12100-046 For luminometry
FBS HyClone SH3091003  
Pen/Strep/Gln(100x) HyClone SV3008201  
B-27 Invitrogen 17504-044  
D-Luciferin Biosynth L-8220  
Poly-L-lysine Sigma P4707  
Polybrene Millipore TR-1003-G  
Forskolin Sigma F6886  
All other chemicals Sigma    
Equipment
Tissue culture incubator     5% CO2 at 37°C
Tissue culture hood     BSL-2 certified
Light & fluorescent microscope     Phase contrast optional
LumiCycle Actimetrics    
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418, 935-941 (2002).
  2. Hastings, M. H., Reddy, A. B., Maywood, E. S. A clockwork web: circadian timing in brain and periphery, in health and disease. Nat. Rev. Neurosci. 4, 649-661 (2003).
  3. Nagoshi, E. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119, 693-705 (2004).
  4. Welsh, D. K. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr. Biol. 14, 2289-2295 (2004).
  5. Liu, A. C. Intercellular coupling confers robustness against mutations in the SCN circadian clock network. Cell. 129, 605-616 (2007).
  6. Kornmann, B. System-driven and oscillator-dependent circadian transcription in mice with a conditionally active liver clock. PLoS Biol. 5, e34 (2007).
  7. Hogenesch, J. B., Herzog, E. D. Intracellular and intercellular processes determine robustness of the circadian clock. FEBS Lett. 585, 1427-1434 (2011).
  8. DeBruyne, J. P., Weaver, D. R., Reppert, S. M. Peripheral circadian oscillators require CLOCK. Curr. Biol. 17, 538-539 (2007).
  9. Liu, A. C. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4, e1000023 (2008).
  10. Zhang, E. E. A genome-wide RNAi screen for modifiers of the circadian clock in human cells. Cell. 139, 199-210 (2009).
  11. Baggs, J. E. Network features of the mammalian circadian clock. PLoS Biol. 7, e52 (2009).
  12. Hirota, T. High-throughput chemical screen identifies a novel potent modulator of cellular circadian rhythms and reveals CKIalpha as a clock regulatory kinase. PLoS Biol. 8, e1000559 (2010).
  13. Ukai-Tadenuma, M. Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function. Cell. 144, 268-281 (2011).
  14. Yamazaki, S., Takahashi, J. S. Real-time luminescence reporting of circadian gene expression in mammals. Methods Enzymol. 393, 288-301 (2005).
  15. Welsh, D. K., Imaizumi, T., Kay, S. A. Real-time reporting of circadian-regulated gene expression by luciferase imaging in plants and mammalian cells. Methods Enzymol. 393, 269-288 (2005).
  16. Sato, T. K. Feedback repression is required for mammalian circadian clock function. Nat. Genet. 38, 312-319 (2006).
  17. Ueda, H. R. System-level identification of transcriptional circuits underlying mammalian circadian clocks. Nat. Genet. 37, 187-192 (2005).
  18. Brown, S. A. The period length of fibroblast circadian gene expression varies widely among human individuals. PLoS Biol. 3, e338 (2005).
  19. Hirota, T. A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20746-20751 (2008).
  20. Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).
  21. Ueda, H. R. A transcription factor response element for gene expression during circadian night. Nature. 418, 534-539 (2002).
  22. Zufferey, R., Donello, J. E., Trono, D., Hope, T. J. Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances expression of transgenes delivered by retroviral vectors. J. Virol. 73, 2886-2892 (1999).
  23. Buhr, E. D., Yoo, S. H., Takahashi, J. S. Temperature as a universal resetting cue for mammalian circadian oscillators. Science. 330, 379-385 (2010).
  24. Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, . U.A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 93, 929-937 (1998).
  25. Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A., Lundkvist, G. B. S. Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus. J. Vis. Exp. (48), e2439 (2011).
  26. Akashi, M., Ichise, T., Mamine, T., Takumi, T. Molecular mechanism of cell-autonomous circadian gene expression of Period2, a crucial regulator of the mammalian circadian clock. Mol. Biol. Cell. 17, 555-565 (2006).
  27. Ohno, T., Onishi, Y., Ishida, N. A novel E4BP4 element drives circadian expression of mPeriod2. Nucleic Acids Res. 35, 648-655 (2007).
  28. Maier, B. A large-scale functional RNAi screen reveals a role for CK2 in the mammalian circadian clock. Genes Dev. 23, 708-718 (2009).
  29. Yoo, S. H. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 5339-5346 (2004).
  30. Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets. Nat. Chem. Biol. 3, 630-639 (2007).
  31. Ko, C. H. Emergence of noise-induced oscillations in the central circadian pacemaker. PLoS Biol. 8, e1000513 (2010).
  32. Izumo, M., Johnson, C. H., Yamazaki, S. Circadian gene expression in mammalian fibroblasts revealed by real-time luminescence reporting: temperature compensation and damping. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16089-16094 (2003).
  33. Izumo, M., Sato, T. R., Straume, M., Johnson, C. H. Quantitative analyses of circadian gene expression in mammalian cell cultures. PLoS Comput. Biol. 2, e136 (2006).
  34. Chen, Z. Identification of diverse modulators of central and peripheral circadian clocks by high-throughput chemical screening. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 101-106 (2011).
  35. Yamaguchi, S. Synchronization of cellular clocks in the suprachiasmatic nucleus. Science. 302, 1408-1412 (2003).
  36. Akashi, M., Hayasaka, N., Yamazaki, S., Node, K. Mitogen-activated protein kinase is a functional component of the autonomous circadian system in the suprachiasmatic nucleus. J. Neurosci. 28, 4619-4623 (2008).
  37. Hoshino, H., Nakajima, Y., Ohmiya, Y. Luciferase-YFP fusion tag with enhanced emission for single-cell luminescence imaging. Nat. Methods. 4, 637-639 (2007).
  38. Asai, M. Visualization of mPer1 transcription in vitro: NMDA induces a rapid phase shift of mPer1 gene in cultured SCN. Curr. Biol. 11, 1524-1527 (2001).
  39. Wilsbacher, L. D. Photic and circadian expression of luciferase in mPeriod1-luc transgenic mice in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 489-494 (2002).
  40. Yamazaki, S. Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats. Science. 288, 682-685 (2000).
  41. Welsh, D. K., Noguchi, T., Yuste, R. Cellular bioluminescence imaging. Imaging: A Laboratory Manual. , 369-385 (2011).
  42. Nakajima, Y. Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging. PLoS One. 5, e10011 (2010).
  43. Guilding, C. A riot of rhythms: neuronal and glial circadian oscillators in the mediobasal hypothalamus. Mol. Brain. 2, 28 (2009).
  44. O’Neill, J. S. cAMP-dependent signaling as a core component of the mammalian circadian pacemaker. Science. 320, 949-953 (2008).
  45. Fuller, P. M., Lu, J., Saper, C. B. Differential rescue of light- and food-entrainable circadian rhythms. Science. 320, 1074-1077 (2008).
  46. Mukherjee, S. Knockdown of Clock in the ventral tegmental area through RNA interference results in a mixed state of mania and depression-like behavior. Biol. Psychiatry. 68, 503-511 (2010).
  47. Saijo, K. A Nurr1/CoREST pathway in microglia and astrocytes protects dopaminergic neurons from inflammation-induced death. Cell. 137, 47-59 (2009).
  48. Elias, G. M. Synapse-specific and developmentally regulated targeting of AMPA receptors by a family of MAGUK scaffolding proteins. Neuron. 52, 307-320 (2006).
  49. Isojima, Y. CKIepsilon/delta-dependent phosphorylation is a temperature-insensitive, period-determining process in the mammalian circadian clock. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 15744-15749 (2009).
  50. Bucan, M., Abel, T. The mouse: genetics meets behaviour. Nat. Rev. Genet. 3, 114-123 (2002).
  51. Hughes, M. E. Harmonics of circadian gene transcription in mammals. PLoS Genet. 5, e1000442 (2009).
  52. Atwood, A. Cell-autonomous circadian clock of hepatocytes drives rhythms in transcription and polyamine synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 18560-18565 (2011).
  53. Panda, S. Coordinated transcription of key pathways in the mouse by the circadian clock. Cell. 109, 307-320 (2002).

Tags

Cell-autonomous Circadian Clock RhythmsGene ExpressionLuciferase Bioluminescence ReportersMammalian Circadian ClocksSleep-wake CyclesLiver MetabolismEndogenous Circadian ClocksSuprachiasmatic Nucleus (SCN)Peripheral ClocksOscillatorsNegative Feedback MechanismCell-based In Vitro AssaysLocomotor ActivitySCN Explants Ex VivoCell-based ModelsClock FunctionTemporal ResolutionReal-time Bioluminescence RecordingFirefly Luciferase Reporter
check_url/kr/4234?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters. J. Vis. Exp. (67), e4234, doi:10.3791/4234 (2012).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image