Modification piggyBac système transposon des cellules T humaines primaires

Summary

Nous décrivons une méthode pour modifier génétiquement des cellules T humaines primaires avec un transgène en utilisant la non-virale<em> PiggyBac</em> Transposon système. Lymphocytes T modifiés à l'aide de la<em> PiggyBac</em> Transposon exposition expression du transgène système stable.

Abstract

Le système piggyBac transposon est active par sa nature, l'origine dérivé de la ^1,2 arpenteuse du chou papillon. Ce système non viral est un plasmide à base, le plus souvent en utilisant deux plasmides avec une expression de l'enzyme transposase piggyBac et un transposon plasmide hébergeant le gène (s) d'intérêt entre répétées inversées d'éléments qui sont nécessaires à l'activité de transfert de gène. PiggyBac transfert de gènes par médiation un "couper et coller" mécanisme par lequel la transposase intègre le segment de transposon dans le génome de la cellule cible (s) d'intérêt. PiggyBac a démontré l'efficacité de délivrance de gènes activité dans une large gamme de ^1,2 insecte, de mammifère ^3-5, et humaine cells6 y compris les cellules T humaines primaires ^7,8. Récemment, une transposase hyperactive piggyBac a été générée en améliorant l'efficacité de transfert de gènes ^9,10.

Lymphocytes T humains sont des intere cliniqueer pour l'immunothérapie adoptive du cancer ^11. Fait à noter, le premier essai clinique impliquant une modification transposon des lymphocytes T humains en utilisant le système Sleeping beauty transposon a été approuvée le ^12. Nous avons déjà évalué l'utilité de piggyBac comme une méthode non virale pour la modification génétique de cellules T humaines. Nous avons trouvé piggyBac pour être efficace dans la modification génétique de cellules T humaines avec un gène rapporteur et un gène non immunogène inductible suicide ^7. L'analyse des sites d'intégration génomique a révélé un manque de préférence pour une intégration dans ou à proximité connues proto-oncogènes ^13. Nous avons utilisé piggyBac de gènes modifient les lymphocytes T cytotoxiques pour réaliser un récepteur d'antigène chimérique dirigé contre l'antigène tumoral HER2, et a trouvé que le gène modifiés lymphocytes T médié assassinat ciblé de HER2-positives cellules tumorales in vitro et in vivo dans un modèle de souris orthotopique ^14. Nous avons également utilisé piggyBacpour générer des cellules T humaines résistantes à la rapamycine, qui devraient être utiles dans les thérapies du cancer, où la rapamycine est utilisée ^15.

Nous décrivons ici une méthode pour utiliser piggyBac de modifier génétiquement les cellules T humaines primaires. Ceci inclut l'isolement des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) à partir de sang humain suivie par la culture, la modification génétique, et l'activation des cellules T. Aux fins du présent rapport, les cellules T ont été modifiées avec un gène rapporteur (eGFP) pour l'analyse et la quantification de l'expression génique par cytométrie en flux.

PiggyBac peuvent être utilisées pour modifier des cellules T avec une variété de gènes d'intérêt. Bien que nous ayons utilisé piggyBac de diriger les lymphocytes T aux antigènes tumoraux ^14, nous avons également utilisé piggyBac d'ajouter un interrupteur de sécurité inductible afin d'éliminer les cellules gènes modifiés si nécessaire ^7. La capacité de chargement importante de piggyBac a également permis le transfert de gènes deune molécule de rapamycine grande résistance mTOR (15 ko) ^15. Par conséquent, nous présentons une méthodologie non-virale pour le gène-modification stable de cellules T humaines primaires pour une large variété de fins.

Protocol

Jour 0 1. Isolation des PBMC à partir de sang humain Recueillir 20 ml de sang humain frais en utilisant ponction veineuse dans des tubes Vacutainer Na-héparine. Mélanger le sang et avancée RPMI 1640 en 1:1 (v / v). Ajouter 20 ml Lymphoprep moyen d'un tube à centrifuger de 50 ml (25 ° C). Lentement couche de 25-30 ml de sang RPMI 1640 mélange sur le dessus du Lymphoprep. Centrifuger à 400 xg pendant 40 min sans freins. Recueillir les…

Representative Results

Un schéma montrant les étapes de la modification génétique de lymphocytes T humains avec un gène rapporteur (eGFP) est illustré à la figure 1. Ces plasmides sont disponibles sur demande auprès des auteurs. Un schemtic démontrant les étapes génétiquement modifiés lymphocytes T humains avec un gène rapporteur (eGFP) est showin dans la figure 2. Il est nécessaire d'activer les cellules T dans le but de les amener à se diviser, se développer et se propager dans la cultu…

Discussion

Le procédé décrit ici permet de modifier transgène stable de lymphocytes T humains primaires. Nous avons déjà testé l'utilisation du système piggyBac transposon pour modifier des cellules T pour exprimer un gène rapporteur (pour plus de 4 semaines), un gène suicide non immunogène, un récepteur d'antigène chimérique pour l'immunothérapie adoptive (pour plus de 100 jours), et à concevoir une résistance aux médicaments immunosuppresseurs ^7,13-15. Non-virale modification des…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Lympholyte	Cedarlane	CL5015
Advanced RPMI 1,640	LifeTechnologies	12633020
Hyclone Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	SH3008803
GlutaMAX-I Supplement	LifeTechnologies	35050-061
Human IL-15 Recombinant Protein	eBioscience	14-8159
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362
Amaxa Nucleofector	Lonza	AAD-1001S
Human T Cell Nucleofector Kit	Lonza	VPA-1002
CD8-APC	Southern Biotech	9536-11
Anti-Human CD3	eBioscience	16-0037-81
Anti-Human CD28	BD Pharmingen	555725
24 Well Tissue Culture Treated Plate	BD Falcon	353047
24 Well Non Tissue Culture Treated Plate	BD Falcon	351147
			Complete T cell media composition 1x Advanced RPMI 1,640 5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum 2 mM GlutamaxIM-I