piggyBac Transposon System Ændring af primære humane T-celler
Summary
Vi beskriver en fremgangsmåde til genetisk at modificere primære humane T-celler med et transgen hjælp af ikke-virale<em> PiggyBac</em> Transposon system. T-celler modificeret til anvendelse af<em> PiggyBac</em> Transposon-system udviser stabil transgenekspression.
Abstract
The piggyBac transposon system er naturligt aktive, oprindeligt afledt af kålmålerlarve moth 1,2. Denne ikke-viral system er plasmidet baseret, mest almindeligt at anvende to plasmider med en udtrykker piggyBac transposase-enzym og en transposon plasmid, gen (er) af interesse mellem inverterede gentagne elementer, som er nødvendige for gen-overførsel-aktivitet. PiggyBac medierer genoverførsel gennem a "cut and paste"-mekanisme, hvorved transposase integrerer transposonet segmentet i genomet af målcellen (erne) af interesse. PiggyBac har vist effektiv genadministration aktivitet i en lang række forskellige insekt 1,2, pattedyr 3-5, og human cells6 herunder primære humane T-celler 7,8. For nylig blev en hyperaktiv transposase piggyBac genereret forbedring genoverførselseffektivitet 9,10.
Humane T-lymfocytter er klinisk interest til adoptiv immunterapi af kræft 11. Af note, er det første kliniske forsøg med transposon modifikation af humane T-celler ved hjælp af Tornerose transposon systemet blevet godkendt 12. Vi har tidligere undersøgt anvendeligheden af piggyBac som en ikke-viral metode til genetisk modificering af humane T-celler. Vi fandt piggyBac at være effektiv til genetisk modifikation af humane T-celler med et reportergen og en ikke-immunogen inducerbar selvmordsgen 7. Analyse af genomiske integrationssteder afslørede en mangel på præference for integration i eller nær kendte proto-onkogener 13. Vi anvendte piggyBac til gen-modificere cytotoksiske T-lymfocytter til at bære et kimært antigen receptor rettet mod tumorantigen HER2, og fandt, at gen-modificerede T-celler medieret målrettet drab af HER2-positive tumorceller in vitro og in vivo i en orthotopisk musemodel 14. Vi har også anvendt piggyBacat generere humane T-celler resistente over for rapamycin, som skulle være nyttige i cancerbehandling, hvor rapamycin anvendes 15.
Heri, beskriver vi en fremgangsmåde til anvendelse piggyBac at gensplejse primære humane T-celler. Dette omfatter isolering af perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) fra humant blod efterfulgt af dyrkning, genetiske modifikation, og aktivering af T-celler. Med henblik på denne rapport blev T-celler modificeret med et reportergen (eGFP) til analyse og kvantificering af genekspression ved flowcytometri.
PiggyBac kan anvendes til at modificere humane T-celler med en række forskellige gener af interesse. Selv om vi har brugt piggyBac at dirigere T-celler til tumorantigener 14, har vi også anvendt piggyBac at tilføje en inducerbar sikkerhedsafbryder for at fjerne gen modificerede celler om nødvendigt 7. Den store lastekapacitet på piggyBac har også muliggjort gen overførsel afen stor rapamycin resistent mTOR-molekyle (15 kb) 15. Derfor præsenterer vi en ikke-viral metode til stabil gen-ændring af primære humane T-celler til en lang række formål.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den heri beskrevne fremgangsmåde giver stabil transgen ændring af primære humane T-lymfocytter. Vi har tidligere testet brugen af piggyBac transposon system til at modificere T-celler til at udtrykke et reportergen (for mere end 4 uger), en ikke-immunogen selvmordsgen, et kimært antigen receptor for adoptiv immunterapi (i mere end 100 dage), og at konstruere modstanden for immunosuppressive lægemidler 7,13-15. Ikke-viral modifikation af T-celler til adoptiv immunterapi og andre anvendelser være…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SS støttes delvis af HHMI Med ind Grad Training Grant gennem TBMM Program. MHW er delvist understøttet af en karriereudvikling pris fra Department of Veterans Affairs og den generøse støtte fra Dr. og Mrs Harold M. Selzman. Dette arbejde blev også delvist understøttet af NIH lymfom SPORE tilskud P50CA126752 og NIH R01 DK093660.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5015 | |
| Advanced RPMI 1,640 | LifeTechnologies | 12633020 | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3008803 | |
| GlutaMAX-I Supplement | LifeTechnologies | 35050-061 | |
| Human IL-15 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8159 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001S | |
| Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| CD8-APC | Southern Biotech | 9536-11 | |
| Anti-Human CD3 | eBioscience | 16-0037-81 | |
| Anti-Human CD28 | BD Pharmingen | 555725 | |
| 24 Well Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 24 Well Non Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 351147 | |
| Complete T cell media composition 1x Advanced RPMI 1,640 5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum 2 mM GlutamaxIM-I |
References
- Cary, L. C. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology. 172 (1), 156 (1989).
- Fraser, M. J. Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA. Virology. 211 (2), 397 (1995).
- Ding, S. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473 (2005).
- Saridey, S. K. PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer. Mol. Ther. 17 (12), 2115 (2009).
- Nakanishi, H. piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice. Mol. Ther. 18 (4), 707 (2010).
- Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells. Mol. Ther. 15 (1), 139 (2007).
- Nakazawa, Y. Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes. J. Immunother. 32 (8), 826 (2009).
- Raja Manuri, P. V. piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 21 (4), 427 (2010).
- Doherty, J. E. Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo. Hum. Gene Ther. , (2011).
- Yusa, K. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531 (2011).
- Bonini, C. Genetic modification of T cells. Biol. Blood Marrow Transplant. 17, S15-S20 (2011).
- Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. A transposon and transposase system for human application. Mol. Ther. 18 (4), 1531 (2010).
- Galvan, D. L. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J. Immunother. 32 (8), 837 (2009).
- Nakazawa, Y. PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor. Mol. Ther. 19 (12), 2133 (2011).
- Huye, L. E. Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination. Mol. Ther. 19 (12), 2239 (2011).
- Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex). J. Immunother. 33 (3), 305 (2010).
- Kahlig, K. M. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343 (2010).
