piggyBac Transposon Systeem Wijziging van primaire menselijke T-cellen
Summary
We beschrijven een werkwijze voor genetisch primaire humane T cellen te veranderen met een transgen via de non-virale<em> PiggyBac</em> Transposon systeem. T-cellen aangepast om met de<em> PiggyBac</em> Transposon systeem vertonen een stabiele expressie van het transgen.
Abstract
Het piggyBac transposon systeem is van nature actief, oorspronkelijk afkomstig van de kool grijper mot 1,2. Deze niet-virale systeem plasmide gebaseerd meest gebruikmakend van twee plasmiden met een expressie de piggyBac transposase enzym en een transposon plasmide het gen (s) plaats tussen inverted repeat elementen die nodig zijn voor genoverdracht activiteit. PiggyBac bemiddeld door genoverdracht een "knip en plak" mechanisme waardoor de transposase het transposon segment geïntegreerd in het genoom van de doelcel (s) plaats. PiggyBac aangetoond efficiënte genafgifte activiteit in diverse insecten 1,2, zoogdieren 3-5, en menselijke cells6 met inbegrip van primaire humane T-cellen 7,8. Onlangs werd een hyperactieve piggyBac transposase gegenereerd verbeteren van genoverdracht efficiëntie 9,10.
Menselijke T lymfocyten van klinische interest voor adoptieve immunotherapie van kanker 11. Van de nota, heeft de eerste klinische studie met transposon modificatie van menselijke T-cellen met behulp van de Doornroosje transposon systeem is goedgekeurd 12. We hebben eerder beoordeelde de bruikbaarheid van piggyBac als niet-virale methoden voor genetische modificatie van humane T-cellen. We vonden piggyBac om efficiënt in genetische modificatie van humane T-cellen met een reportergen en een niet-immunogene induceerbare zelfmoordgentherapie 7. Analyse van genomische integratieplaatsen gebleken dat er geen voorkeur voor integratie in of nabij bekende proto-oncogenen 13. We gebruikten piggyBac gen-passen cytotoxische T-lymfocyten een chimeer antigen receptor gericht tegen het tumor antigen HER2 dragen, en dat gen-gemodificeerde T-cellen gemedieerd gericht doden van HER2-positieve tumorcellen in vitro en in vivo in een muizenmodel orthotope 14. We hebben ook piggyBacmenselijke T-cellen tegen rapamycine, die van nut zijn in kankerbehandelingen waar rapamycine wordt gebruikt 15 genereren.
Hierin beschrijven we een methode om met piggyBac genetisch te modificeren primaire humane T cellen. Dit omvat isolatie van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) uit menselijk bloed gevolgd door kweek, genetische modificatie, en activering van T-cellen. Ten behoeve van dit rapport werden T cellen gemodificeerd met een reportergen (eGFP) voor analyse en kwantificering van genexpressie door flowcytometrie.
PiggyBac kan worden gebruikt om menselijke T-cellen te passen met verschillende genen van interesse. Hoewel we gebruik piggyBac T-cellen voor tumorantigenen 14 sturen, hebben we ook een induceerbare piggyBac veiligheidsschakelaar toevoegen om genetisch gemanipuleerde cellen te elimineren indien nodig 7. De grote laadvermogen van piggyBac is ook mogelijk genoverdracht vaneen grote rapamycine resistent mTOR molecuul (15 kb) 15. Daarom presenteren we een niet-virale methodologie voor stabiele gen-modificatie van primaire humane T cellen voor diverse doeleinden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hierin beschreven werkwijze worden stabiele transgene modificatie van primaire menselijke T-lymfocyten. We hebben eerder geteste het gebruik van het piggyBac transposon systeem T-cellen wijzigen om een reportergen (meer dan 4 weken), een niet-immunogene suïcidegen een chimeer antigen receptor voor adoptieve immunotherapie (langer dan 100 dagen) te drukken, en om de weerstand ingenieur aan immunosuppressieve geneesmiddelen 7,13-15. Niet-virale modificatie van T cellen voor adoptieve immunotherapie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SS wordt gedeeltelijk ondersteund door de HHMI Med in Grad Training Grant door de TBMM Program. MHW wordt gedeeltelijk ondersteund door een loopbaanontwikkeling onderscheiding van de Department of Veterans Affairs en de genereuze steun van dr. en mevrouw Harold M. Selzman. Dit werk werd ook gedeeltelijk ondersteund door NIH lymfoom SPORE subsidie P50CA126752 en NIH R01 DK093660.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5015 | |
| Advanced RPMI 1,640 | LifeTechnologies | 12633020 | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3008803 | |
| GlutaMAX-I Supplement | LifeTechnologies | 35050-061 | |
| Human IL-15 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8159 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001S | |
| Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| CD8-APC | Southern Biotech | 9536-11 | |
| Anti-Human CD3 | eBioscience | 16-0037-81 | |
| Anti-Human CD28 | BD Pharmingen | 555725 | |
| 24 Well Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 24 Well Non Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 351147 | |
| Complete T cell media composition 1x Advanced RPMI 1,640 5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum 2 mM GlutamaxIM-I |
References
- Cary, L. C. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology. 172 (1), 156 (1989).
- Fraser, M. J. Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA. Virology. 211 (2), 397 (1995).
- Ding, S. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473 (2005).
- Saridey, S. K. PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer. Mol. Ther. 17 (12), 2115 (2009).
- Nakanishi, H. piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice. Mol. Ther. 18 (4), 707 (2010).
- Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells. Mol. Ther. 15 (1), 139 (2007).
- Nakazawa, Y. Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes. J. Immunother. 32 (8), 826 (2009).
- Raja Manuri, P. V. piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 21 (4), 427 (2010).
- Doherty, J. E. Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo. Hum. Gene Ther. , (2011).
- Yusa, K. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531 (2011).
- Bonini, C. Genetic modification of T cells. Biol. Blood Marrow Transplant. 17, S15-S20 (2011).
- Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. A transposon and transposase system for human application. Mol. Ther. 18 (4), 1531 (2010).
- Galvan, D. L. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J. Immunother. 32 (8), 837 (2009).
- Nakazawa, Y. PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor. Mol. Ther. 19 (12), 2133 (2011).
- Huye, L. E. Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination. Mol. Ther. 19 (12), 2239 (2011).
- Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex). J. Immunother. 33 (3), 305 (2010).
- Kahlig, K. M. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343 (2010).
