piggyBac Transposón modificación del sistema de células T humanas primarias
Summary
Se describe un método para modificar genéticamente las células T humanas primarias con un transgén mediante el no viral<em> PiggyBac</em> Transposón sistema. Células T modificado para usar el<em> PiggyBac</em> Transposón expresión sistema de exhibición transgén estable.
Abstract
El sistema de transposón piggyBac es naturalmente activo, originalmente derivado del 1,2 falso medidor polilla. Este sistema no viral es el plásmido basada, más comúnmente utilizando dos plásmidos con uno que expresa la enzima transposasa piggyBac y un transposón plásmido que alberga el gen (s) de interés entre los elementos de repetición invertida que se requieren para la actividad de transferencia génica. PiggyBac media la transferencia de genes a través un "cortar y pegar" mecanismo por el que la transposasa integra el segmento de transposón en el genoma de la célula diana (s) de interés. PiggyBac ha demostrado actividad eficiente de suministro de genes en una amplia variedad de 1,2 insectos, mamíferos 3-5, y humano cells6 incluyendo células T humanas primarias 7,8. Recientemente, una transposasa hiperactiva piggyBac fue generado mejorar la eficiencia de transferencia génica 9,10.
Los linfocitos T humanos son de intere clínicast para la inmunoterapia adoptiva del cáncer 11. Es de destacar que el primer ensayo clínico que incluyó la modificación transposón de células T humanas mediante el sistema transposón Sleeping beauty ha aprobado 12. Anteriormente hemos evaluado la utilidad de piggyBac como una metodología no viral para la modificación genética de las células T humanas. Hemos encontrado piggyBac ser eficaz en la modificación genética de las células T humanas con un gen informador y un gen inducible no inmunogénica suicida 7. Análisis de los sitios de integración genómica reveló una falta de preferencia para la integración en o cerca de conocidos proto-oncogenes 13. Se utilizó piggyBac para modificar genes linfocitos T citotóxicos para llevar a un receptor de antígeno quimérico dirigido contra el antígeno tumor HER2, y encontraron que las células modificadas con gen-T mediada asesinato selectivo de HER2-positivas las células tumorales in vitro e in vivo en un modelo de ratón ortotópico 14. También hemos utilizado piggyBacpara generar las células T humanas resistentes a la rapamicina, que debe ser útil en terapias para el cáncer donde la rapamicina se utilizaron 15.
En este documento, se describe un método para utilizar piggyBac para modificar genéticamente células T humanas primarias. Esto incluye el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de sangre humana seguido de cultivo, modificación del gen, y la activación de las células T. Para el propósito de este informe, las células T fueron modificados con un gen reportero (eGFP) para el análisis y la cuantificación de la expresión génica mediante citometría de flujo.
PiggyBac se puede utilizar para modificar las células T humanas con una variedad de genes de interés. Aunque hemos utilizado piggyBac dirigir a las células T a antígenos tumorales 14, también hemos utilizado piggyBac para añadir un interruptor de seguridad inducible con el fin de eliminar las células de genes modificados si es necesario 7. La gran capacidad de carga de piggyBac también ha permitido la transferencia de genes deuna gran resistencia rapamicina moléculas mTOR (15 kb) 15. Por lo tanto, se presenta una metodología no viral para estable de genes modificación de células T humanas primarias para una amplia variedad de propósitos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método descrito en la presente memoria permite la modificación transgén estable de linfocitos T primarios humanos. Anteriormente hemos probado el uso del sistema de transposón piggyBac para modificar las células T para expresar un gen reportero (por más de 4 semanas), un gen suicida no inmunogénico, un receptor de antígeno quimérico para la inmunoterapia adoptiva (durante más de 100 días), y para diseñar la resistencia a los medicamentos inmunosupresores 7,13-15. No viral modificación…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SS es apoyado en parte por el Mediterráneo HHMI en Grad formación de subvención a través del Programa TBMM. MHW es apoyado en parte por un premio de desarrollo de carrera en el Departamento de Asuntos de Veteranos y el generoso apoyo del Dr. y la Sra. Harold M. Selzman. Este trabajo fue apoyado en parte por el NIH subvención SPORE linfoma P50CA126752 y NIH R01 DK093660.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5015 | |
| Advanced RPMI 1,640 | LifeTechnologies | 12633020 | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3008803 | |
| GlutaMAX-I Supplement | LifeTechnologies | 35050-061 | |
| Human IL-15 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8159 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001S | |
| Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| CD8-APC | Southern Biotech | 9536-11 | |
| Anti-Human CD3 | eBioscience | 16-0037-81 | |
| Anti-Human CD28 | BD Pharmingen | 555725 | |
| 24 Well Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 24 Well Non Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 351147 | |
| Complete T cell media composition 1x Advanced RPMI 1,640 5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum 2 mM GlutamaxIM-I |
References
- Cary, L. C. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology. 172 (1), 156 (1989).
- Fraser, M. J. Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA. Virology. 211 (2), 397 (1995).
- Ding, S. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473 (2005).
- Saridey, S. K. PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer. Mol. Ther. 17 (12), 2115 (2009).
- Nakanishi, H. piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice. Mol. Ther. 18 (4), 707 (2010).
- Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells. Mol. Ther. 15 (1), 139 (2007).
- Nakazawa, Y. Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes. J. Immunother. 32 (8), 826 (2009).
- Raja Manuri, P. V. piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 21 (4), 427 (2010).
- Doherty, J. E. Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo. Hum. Gene Ther. , (2011).
- Yusa, K. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531 (2011).
- Bonini, C. Genetic modification of T cells. Biol. Blood Marrow Transplant. 17, S15-S20 (2011).
- Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. A transposon and transposase system for human application. Mol. Ther. 18 (4), 1531 (2010).
- Galvan, D. L. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J. Immunother. 32 (8), 837 (2009).
- Nakazawa, Y. PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor. Mol. Ther. 19 (12), 2133 (2011).
- Huye, L. E. Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination. Mol. Ther. 19 (12), 2239 (2011).
- Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex). J. Immunother. 33 (3), 305 (2010).
- Kahlig, K. M. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343 (2010).
