Измерение антител воздействие на клеточные функции кардиомиоцитов изолированного
Summary
Представленный метод предлагает способ определения функционального эффективной кардиотропной аутоантител в плазме пациентов с дилатационной кардиомиопатией, независимо от специфического антигена, анализируя влияние изолированного иммуноглобулина пациента на клеточном сокращения и внутриклеточного кальция в переходных изолированные кардиомиоцитов крысы.
Abstract
Дилатационная кардиомиопатия (DCM) является одной из основных причин сердечной недостаточности у молодых взрослых 1. Хотя генетическая предрасположенность и экспозиции воздействию токсичных веществ известны причины этого заболевания примерно у одной трети пациентов, происхождение DCM остается во многом неясной. В Значительное число этих больных аутоантител против сердечных эпитопы были обнаружены и, как предполагается, играют ключевую роль в возникновении и прогрессировании заболевания 2,3. Важность сердечного аутоантител подчеркивается улучшение гемодинамики наблюдается в DCM пациентам после удаления аутоантител к иммуноадсорбции 3-5. Различные специфические антигены уже определены 2,3 и антитела против этих целей могут быть обнаружены с помощью иммуноанализа. Тем не менее, эти методы не могут различать стимулирование (и, следовательно, функционально эффективными) и блокирование аутоантител. Там растет Доказательство томсе, что это различие имеет решающее значение 6,7. Можно также предположить, что цели для ряда кардиотропной антитела еще неизвестные и поэтому не могут быть обнаружены с помощью иммуноанализа. Таким образом, мы создали метод для выявления функционально активных кардиотропной антител, независимо от их соответствующим антигеном. Фон для метода является высокая гомология обычно наблюдаются функциональные области сердечной белков между млекопитающими 8,9. Это означает, что сердечные антител, направленных против антигенов человека будет перекрестно реагируют с не-человека клетки-мишени, которая позволяет тестирование IgG у пациентов DCM на взрослых кардиомиоцитов крысы. Наш метод состоит из 3 шагов: во-первых, IgG изолирован от пациента плазмы с помощью сефарозы связанных анти-IgG антител, полученных из столбцов иммуноадсорбции (PlasmaSelect, Teterow, Германия). Во-вторых, взрослые кардиомиоциты выделяют коллагеназы перфузии в аппарат Лангендорфа перфузии Использование AProtocol изменения от предыдущих работах 10,11. Полученные кардиомиоциты, которые прикреплены к ламинин покрытием камерных coverglasses и окрашивали Фура-2, кальций-селективный флуоресцентный краситель, который может быть легко приведена в клетке для наблюдения внутриклеточного кальция (Ca 2 +) содержание 12. В последнем шаге, эффект от пациента IgG на сокращение клеток и Ca 2 + переходных полей стимулировали кардиомиоцитов контролируется в Интернете с помощью коммерческих миоцитов кальцием и сократительной системы мониторинга (IonOptix, Милтон, Массачусетс, США), подключенный к стандартному обратный флуоресцентный микроскопом.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представленный метод предлагает подходящий способ обнаружения функционально эффективными сердечными аутоантитела у больных с DCM неясного происхождения. По сравнению с другими методами, например, выявление функциональных активные антитела против β1-адренорецепторов их влияние …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Sonderforschungsbereich Transregio 19 (SFB/TR19, C2) из Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Федерального министерства экономики и технологий проект ЗИМ-KF 2727801MD0 и Центра инновационных компетенций – гуморальный иммунный ответ сердечно-сосудистых заболеваний ( ZIK-поход, BMBF ФКЗ 03Z2CN12) Федерального министерства образования и научных исследований Германии. Жилищного строительства и экспериментах на животных были проведены в соответствии с рекомендациями Общество лабораторных животных науки (Gesellschaft für Versuchstierkunde, GV-СОЛАС) и Федерации европейских лабораторных животных Science Association (FELASA).
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Immunosorba preservation solution | Fresenius Medical Care | 903609211 | |
| Collagenase type 2 | Cell System | LS004176 | |
| BSA, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Fura-2 AM | Sigma-Aldrich | F0888 | 1 mg/ml in DMSO |
| Econo Pac Chromatography Columns | BioRad | 732-1010 | |
| Spectra/Por Biotech Cellulose Ester Dialysis Membrane | Spectrumlabs | 131417 | |
| 4 well Chambered Coverglass | Nunc | 155383 | |
| Myocyte Calcium and Contractility Recording System | IonOptix | ||
| IonWizard 6.0 analysis software | IonOptix |
References
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics–2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18 (2011).
- Caforio, A. L., Vinci, A., Iliceto, S. Anti-heart autoantibodies in familial dilated cardiomyopathy. Autoimmunity. 41 (6), 462 (2008).
- Yoshikawa, T., Baba, A., Nagatomo, Y. Autoimmune mechanisms underlying dilated cardiomyopathy. Circ. J. 73 (4), 602 (2009).
- Felix, S. B., et al. Hemodynamic effects of immunoadsorption and subsequent immunoglobulin substitution in dilated cardiomyopathy: Three-month results from a randomized study. Journal of the American College of Cardiology. 35 (6), 1590 (2000).
- Staudt, A., et al. Role of immunoglobulin G3 subclass in dilated cardiomyopathy: results from protein A immunoadsorption. Am. Heart J. 150 (4), 729 (2005).
- Nikolaev, V. O., et al. A novel fluorescence method for the rapid detection of functional beta1-adrenergic receptor autoantibodies in heart failure. J. Am. Coll. Cardiol. 50 (5), 423 (2007).
- Jahns, R., et al. Autoantibodies activating human beta1-adrenergic receptors are associated with reduced cardiac function in chronic heart failure. Circulation. 99 (5), 649 (1999).
- Gocayne, J., et al. Primary structure of rat cardiac beta-adrenergic and muscarinic cholinergic receptors obtained by automated DNA sequence analysis: further evidence for a multigene family. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (23), 8296 (1987).
- Jaenicke, T., et al. The complete sequence of the human beta-myosin heavy chain gene and a comparative analysis of its product. Genomics. 8 (2), 194 (1990).
- Piper, H. M., Volz, A., Schwartz, P., Piper, H. M. . Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research. , (1990).
- Kubin, T., et al. Microvascular endothelial cells remodel cultured adult cardiomyocytes and increase their survival. Am. J. Physiol. 276 (6 Pt. 2), H2179 (1999).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260 (6), 3440 (1985).
- Magnusson, Y., et al. Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization of antibodies against the beta 1-adrenoceptor with positive chronotropic effect. Circulation. 89 (6), 2760 (1994).
- Wakefield, I. D., et al. The application of in vitro methods to safety pharmacology. Fundam. Clin. Pharmacol. 16 (3), 209 (2002).
- Kajzar, A., et al. Toward physiological conditions for cell analyses: forces of heart muscle cells suspended between elastic micropillars. Biophys. J. 94 (5), 1854 (2008).
