Meting van antilichaam Effecten op cellulaire functie van geïsoleerde cardiomyocyten
Summary
De onderhavige methode biedt een manier om functioneel effectieve cardiotropic auto-antilichamen te detecteren in het plasma van patiënten met gedilateerde cardiomyopathie, ongeacht de specifieke antigen, door analyse van het effect van geïsoleerde patiënt immunoglobuline op cellulaire verkorten en intracellulair calcium transiënten in geïsoleerde cardiomyocyten van de rat.
Abstract
Gedilateerde cardiomyopathie (DCM) is een van de belangrijkste oorzaken van hartfalen bij jongere volwassenen 1. Hoewel genetische aanleg en blootstelling aan toxische stoffen bekende oorzaken van deze ziekte bij ongeveer eenderde van de patiënten, de oorsprong van DCM grotendeels onduidelijk. In een groot aantal van deze patiënten hebben autoantilichamen tegen cardiale epitopen gedetecteerd en wordt vermoed een centrale rol spelen bij de ontwikkeling en progressie van de ziekte 2,3. Het belang van cardiale autoantilichamen wordt onderstreept door een hemodynamische verbetering waargenomen met DCM patiënten na verwijdering van auto-antistoffen door immunoadsorptie 3-5. Een verscheidenheid van specifieke antigenen zijn reeds geïdentificeerd 2,3 en antilichamen tegen deze targets worden gedetecteerd door immunoassays. Maar deze assays geen onderscheid maken tussen stimuleren (en dus functioneel effectief) en blokkeren autoantilichamen. Er steeds evidence dat dit onderscheid is cruciaal 6,7. Ook kan worden uitgegaan dat de targets voor een aantal cardiotropic antilichamen nog niet geïdentificeerd zijn en dus niet worden gedetecteerd door immunoassays. Daarom hebben we een methode voor de detectie van antilichamen functioneel actief cardiotropic, onafhankelijk van hun antigen. De achtergrond van de werkwijze is de hoge homologie meestal waargenomen voor functionele regio van cardiale eiwitten in zoogdieren tussen 8,9. Dit suggereert dat cardiale antilichamen gericht tegen humane antigenen zullen kruisreageren met niet-menselijke doelwitcellen die testen van IgG kunnen uit DCM patiënten volwassen cardiomyocyten van de rat. De methode bestaat uit drie stappen: eerst IgG geïsoleerd uit patiënten met plasma sepharose gekoppelde anti-IgG antilichamen verkregen uit immunoadsorptie kolom (PlasmaSelect, Teterow, Duitsland). Tweede volwassen hartspiercellen worden geïsoleerd door collagenase perfusie in een Langendorff perfusie inrichting met apROTOCOL gewijzigd ten opzichte van eerdere werken 10,11. De verkregen hartspiercellen zijn aan laminine beklede chambered coverglasses en gekleurd met Fura-2, een calcium-selectieve fluorescerende kleurstof die gemakkelijk kunnen worden gebracht in de cel om intracellulaire calcium nemen (Ca 2 +) inhoud 12. In de laatste stap, het effect van IgG patiënt op de cel verkorten en Ca 2 + transiënten van gebied gestimuleerde cardiomyocyten wordt online gevolgd met een commerciële myocyte calcium en contractiliteit controlesysteem (IonOptix, Milton, MA, USA) aan een standaard inverse fluorescent microscoop.
Protocol
Representative Results
Discussion
De gepresenteerde methode biedt een geschikte manier om functioneel effectieve cardiale autoantilichamen te sporen bij patiënten met DCM van onduidelijke herkomst. In vergelijking met andere methoden, de detectie van functionele actieve antilichamen tegen de β1-adrenoceptor bijvoorbeeld door het effect op cAMP niveaus 6, onze methode is onafhankelijk van een specifiek epitoop. Natuurlijk zijn er andere epitoop onafhankelijke proeven in de literatuur beschreven, namelijk het tellen van de g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Sonderforschungsbereich TransRegio 19 (SFB/TR19, C2) van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), het federale ministerie van Economie en Technologie project ZIM-KF 2727801MD0 en het Centrum voor Innovatie Competence – humorale immuunresponsen in Hart-en vaatziekten ( ZIK-HIKE, BMBF FKZ 03Z2CN12) van het ministerie van Onderwijs en Onderzoek, Duitsland. Huisvesting en experimenten met dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van de Vereniging voor Proefdierkunde (Gesellschaft für Versuchstierkunde, GV-SOLAS) en de Federatie van Europese Laboratory Animal Science Association (FELASA).
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Immunosorba preservation solution | Fresenius Medical Care | 903609211 | |
| Collagenase type 2 | Cell System | LS004176 | |
| BSA, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Fura-2 AM | Sigma-Aldrich | F0888 | 1 mg/ml in DMSO |
| Econo Pac Chromatography Columns | BioRad | 732-1010 | |
| Spectra/Por Biotech Cellulose Ester Dialysis Membrane | Spectrumlabs | 131417 | |
| 4 well Chambered Coverglass | Nunc | 155383 | |
| Myocyte Calcium and Contractility Recording System | IonOptix | ||
| IonWizard 6.0 analysis software | IonOptix |
References
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics–2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18 (2011).
- Caforio, A. L., Vinci, A., Iliceto, S. Anti-heart autoantibodies in familial dilated cardiomyopathy. Autoimmunity. 41 (6), 462 (2008).
- Yoshikawa, T., Baba, A., Nagatomo, Y. Autoimmune mechanisms underlying dilated cardiomyopathy. Circ. J. 73 (4), 602 (2009).
- Felix, S. B., et al. Hemodynamic effects of immunoadsorption and subsequent immunoglobulin substitution in dilated cardiomyopathy: Three-month results from a randomized study. Journal of the American College of Cardiology. 35 (6), 1590 (2000).
- Staudt, A., et al. Role of immunoglobulin G3 subclass in dilated cardiomyopathy: results from protein A immunoadsorption. Am. Heart J. 150 (4), 729 (2005).
- Nikolaev, V. O., et al. A novel fluorescence method for the rapid detection of functional beta1-adrenergic receptor autoantibodies in heart failure. J. Am. Coll. Cardiol. 50 (5), 423 (2007).
- Jahns, R., et al. Autoantibodies activating human beta1-adrenergic receptors are associated with reduced cardiac function in chronic heart failure. Circulation. 99 (5), 649 (1999).
- Gocayne, J., et al. Primary structure of rat cardiac beta-adrenergic and muscarinic cholinergic receptors obtained by automated DNA sequence analysis: further evidence for a multigene family. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (23), 8296 (1987).
- Jaenicke, T., et al. The complete sequence of the human beta-myosin heavy chain gene and a comparative analysis of its product. Genomics. 8 (2), 194 (1990).
- Piper, H. M., Volz, A., Schwartz, P., Piper, H. M. . Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research. , (1990).
- Kubin, T., et al. Microvascular endothelial cells remodel cultured adult cardiomyocytes and increase their survival. Am. J. Physiol. 276 (6 Pt. 2), H2179 (1999).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260 (6), 3440 (1985).
- Magnusson, Y., et al. Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization of antibodies against the beta 1-adrenoceptor with positive chronotropic effect. Circulation. 89 (6), 2760 (1994).
- Wakefield, I. D., et al. The application of in vitro methods to safety pharmacology. Fundam. Clin. Pharmacol. 16 (3), 209 (2002).
- Kajzar, A., et al. Toward physiological conditions for cell analyses: forces of heart muscle cells suspended between elastic micropillars. Biophys. J. 94 (5), 1854 (2008).
