Die Messung der Antikörper Auswirkungen auf zelluläre Funktion von isolierten Kardiomyozyten
Summary
Die vorgestellte Methode bietet eine Möglichkeit, funktionelle wirksame kardiotropen Autoantikörpern im Plasma von Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie erfassen, unabhängig von dem spezifischen Antigen, durch Analyse der Auswirkung der isolierten Immunglobulin Patienten auf zelluläre Backfett und intrazellulärem Calcium in isolierter Transienten Rattenkardiomyozyten.
Abstract
Die dilatative Kardiomyopathie (DCM) ist eine der Hauptursachen für Herzinsuffizienz bei jüngeren Erwachsenen 1. Obwohl genetische Disposition und Exposition gegenüber toxischen Substanzen Ursachen für diese Erkrankung in etwa einem Drittel der Patienten bekannt sind, bleibt der Ursprung der DCM weitgehend unklar. In einer beträchtlichen Anzahl dieser Patienten haben Autoantikörper gegen kardiale Epitope erkannt und stehen im Verdacht, eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und Progression der Erkrankung 2,3 spielen. Die Bedeutung der kardialen Autoantikörper wird durch eine hämodynamische Verbesserung DCM-Patienten nach der Eliminierung von Autoantikörpern durch Immunadsorption 3-5 beobachtet unterstrichen. Eine Vielzahl von spezifischen Antigenen wurden bereits identifiziert und 2,3 Antikörper gegen diese Ziele können durch Immunoassays nachgewiesen werden. Allerdings können diese Assays nicht zwischen Stimulierung (und daher funktionell wirksame) und Blockieren Autoantikörpern diskriminieren. Es gibt immer mehr evidence, dass diese Unterscheidung wichtig 6,7 ist. Es kann auch angenommen werden, dass die Ziele für eine Reihe von Antikörpern kardiotropen noch unidentifizierten und daher nicht durch Immunoassays nachgewiesen werden können. Daher haben wir ein Verfahren zum Nachweis von funktionell aktiven Antikörpern kardiotropen, unabhängig von ihrer jeweiligen Antigen. Der Hintergrund für das Verfahren ist die hohe Homologie der Regel für funktionelle Bereiche der kardialen Proteinen in Säugern zwischen 8,9 beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass Antikörper gegen menschliches Herz-Antigene gerichtet wird mit nicht-humanen Zielzellen, die Prüfung von IgG aus DCM ermöglicht Patienten an adulten Rattenkardiomyozyten kreuzreagieren. Unsere Methode besteht aus 3 Schritten: Zunächst IgG aus Patientenplasma mit Sepharose gekoppelten anti-IgG-Antikörper aus Immunadsorption Spalten (PlasmaSelect, Teterow, Deutschland) isoliert. Zweitens adulten Kardiomyozyten durch Kollagenase Perfusion in einem Langendorff Perfusionsapparatur mit ap isoliertROTOKOLLS aus früheren Werken 10,11 modifiziert. Die erhaltenen Kardiomyozyten an Laminin beschichteten Deckgläsern gekammerten befestigt und gefärbt mit Fura-2, ein Calcium-selektiven Fluoreszenzfarbstoff, der leicht in die Zelle gebracht werden kann, um die intrazelluläre Calcium beobachten (Ca 2 +)-Inhalt 12. Im letzten Schritt wird die Wirkung der Patient auf dem IgG Zellverkürzung und Ca 2 + Transienten Feld stimuliert Kardiomyozyten wird online unter Verwendung eines kommerziellen Myozyten Calcium und Kontraktilität Überwachungssystem (IonOptix, Milton, MA, USA), die mit einer Standard-inversen fluoreszierenden überwachten Mikroskop.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die vorgestellte Methode bietet einen geeigneten Weg, um funktionell wirksame kardiale Autoantikörper bei Patienten mit DCM unklarer Herkunft zu erkennen. Im Vergleich zu anderen Methoden, wie zB die Erfassung von funktionell aktiven Antikörper gegen den β1-Adrenozeptor durch ihre Auswirkungen auf die cAMP-Spiegel 6, ist unsere Methode unabhängig von einem bestimmten Epitop. Selbstverständlich gibt es andere Epitop unabhängigen Assays in der Literatur beschrieben, dh Zählen der Schlag…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Humorale Immunantworten in Cardiovascular Diseases (- Diese Arbeit wurde durch den Sonderforschungsbereich Transregio 19 (SFB/TR19, C2) der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG), das Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie Projekt ZIM-KF 2727801MD0 und das Zentrum für Innovationskompetenz unterstützt ZIK-Wanderung, BMBF FKZ 03Z2CN12) des Bundesministeriums für Bildung und Forschung, Deutschland. Gehäuse und Experimente mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Society for Laboratory Animal Science (Gesellschaft für Versuchstierkunde GV-SOLAS) und der Federation of European Laboratory Animal Science Association (FELASA) durchgeführt.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Immunosorba preservation solution | Fresenius Medical Care | 903609211 | |
| Collagenase type 2 | Cell System | LS004176 | |
| BSA, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Fura-2 AM | Sigma-Aldrich | F0888 | 1 mg/ml in DMSO |
| Econo Pac Chromatography Columns | BioRad | 732-1010 | |
| Spectra/Por Biotech Cellulose Ester Dialysis Membrane | Spectrumlabs | 131417 | |
| 4 well Chambered Coverglass | Nunc | 155383 | |
| Myocyte Calcium and Contractility Recording System | IonOptix | ||
| IonWizard 6.0 analysis software | IonOptix |
References
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