Misurazione degli effetti degli anticorpi sulla funzione cellulare di cardiomiociti isolati
Summary
Il metodo proposto offre un modo per rilevare funzionali autoanticorpi cardiotropic efficaci nel plasma di pazienti con cardiomiopatia dilatativa, indipendentemente l'antigene specifico, analizzando l'impatto di immunoglobulina paziente isolato su accorciamento cellulare e transienti di calcio intracellulare in cardiomiociti isolati di ratto.
Abstract
Cardiomiopatia dilatativa (DCM) è una delle principali cause di insufficienza cardiaca nei giovani adulti 1. Sebbene predisposizione genetica ed esposizione a sostanze tossiche sono note cause per questa malattia in circa un terzo dei pazienti, l'origine di DCM rimane poco chiara. In un numero considerevole di questi pazienti, gli anticorpi contro epitopi cardiaci sono stati individuati e sono sospettati di svolgere un ruolo centrale nella insorgenza e la progressione della malattia 2,3. L'importanza di autoanticorpi cardiache è sottolineata da un miglioramento emodinamico osservato nei pazienti DCM dopo l'eliminazione di autoanticorpi da immunoassorbimento 3-5. Una varietà di antigeni specifici sono già stati individuati 2,3 e anticorpi contro tali obiettivi possono essere rilevati da immunosaggi. Tuttavia, questi test non può discriminare tra stimolante (e quindi funzionalmente efficaci) e bloccando autoanticorpi. Vi è una crescente evidence che questa distinzione è cruciale 6,7. Si può anche ritenere che gli obiettivi di un certo numero di anticorpi cardiotropic sono ancora da identificare e pertanto non può essere rilevato dal test immunologici. Pertanto, abbiamo stabilito un metodo per la rilevazione di anticorpi funzionalmente attivi cardiotropic, indipendentemente dal loro rispettivo antigene. Lo sfondo per il metodo è l'alta omologia di solito osservata per le regioni funzionali di proteine cardiache nei mammiferi tra 8,9. Questo suggerisce che gli anticorpi diretti contro antigeni cardiaci umani reazione crociata con non umani cellule bersaglio, che permette prove di IgG da pazienti DCM su cardiomiociti di ratto adulto. Il nostro metodo si compone di 3 fasi: la prima, IgG è isolato dal plasma del paziente con sefarosio accoppiati anti-IgG anticorpi ottenuti da colonne immunoassorbimento (PlasmaSelect, Teterow, Germania). Secondo, cardiomiociti adulti sono isolati mediante perfusione con collagenasi in un apparato perfusione Langendorff utilizzando apROTOCOLLO modificato da lavori precedenti 10,11. I cardiomiociti ottenuti sono allegati alla laminina rivestite chambered vetrini colorati con Fura-2, un inibitore selettivo colorante fluorescente che può essere facilmente portato nella cella di osservare intracellulare di calcio (Ca 2 +) contenuti 12. Nell'ultimo passaggio, l'effetto del paziente IgG sulla riduzione delle cellule e Ca 2 + transitori di cardiomiociti campo stimolate è monitorato on-line utilizzando un calcio commerciale miociti e sistema di monitoraggio contrattilità (IonOptix, Milton, MA, USA) collegato ad una fluorescente standard di inversa microscopio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo proposto offre un modo adatto a rilevare autoanticorpi funzionalmente efficaci cardiaci in pazienti con DCM di origine poco chiara. In confronto ad altri metodi, ad esempio il rilevamento di anticorpi funzionali attivi contro l'β1-adrenocettori da loro impatto sui livelli di cAMP 6, il nostro metodo è indipendente da uno specifico epitopo. Naturalmente ci sono altri saggi indipendenti epitopi descritti nella letteratura, cioè contando il tasso battendo cardiomiociti neonatal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Transregio Sonderforschungsbereich 19 (SFB/TR19, C2) della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), il Ministero Federale dell'Economia e della Tecnologia progetto ZIM-KF 2727801MD0 e il Centro di Competenza Innovation – risposte immunitarie umorali in Malattie Cardiovascolari ( ZIK-ESCURSIONE, BMBF FKZ 03Z2CN12) del Ministero federale dell'Istruzione e della Ricerca, in Germania. Corpo e gli esperimenti con gli animali sono stati eseguiti in conformità con le raccomandazioni della Società per Laboratorio Scienze Animali (Gesellschaft für Versuchstierkunde, GV-SOLAS) e la Federazione di Laboratorio europeo di Animal Science Association (FELASA).
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Immunosorba preservation solution | Fresenius Medical Care | 903609211 | |
| Collagenase type 2 | Cell System | LS004176 | |
| BSA, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Fura-2 AM | Sigma-Aldrich | F0888 | 1 mg/ml in DMSO |
| Econo Pac Chromatography Columns | BioRad | 732-1010 | |
| Spectra/Por Biotech Cellulose Ester Dialysis Membrane | Spectrumlabs | 131417 | |
| 4 well Chambered Coverglass | Nunc | 155383 | |
| Myocyte Calcium and Contractility Recording System | IonOptix | ||
| IonWizard 6.0 analysis software | IonOptix |
References
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