Medição dos Efeitos de anticorpos sobre a função celular de cardiomiócitos isolados
Summary
O método apresentado oferece um modo para detectar auto-anticorpos funcionais eficazes cardiotrópicos no plasma de pacientes com cardiomiopatia dilatada, independentemente do antigénio específico, por meio da análise do impacto da imunoglobulina paciente isolado no encurtamento celular e os transientes de cálcio intracelular em cardiomiócitos de ratos isolados.
Abstract
Cardiomiopatia dilatada (CMD) é uma das principais causas para a insuficiência cardíaca em adultos mais jovens 1. Embora predisposição genética e exposição a substâncias tóxicas são causas conhecidas para essa doença em cerca de um terço dos pacientes, a origem de DCM permanece amplamente claro. Num número substancial de pacientes, os auto-anticorpos contra epítopos cardíacos foram detectados e são suspeitos de desempenhar um papel crucial na iniciação e progressão da doença de 2,3. A importância dos anticorpos cardíacos é sublinhado por uma melhoria hemodinâmica observada em pacientes com CMD após a eliminação de auto-anticorpos por imunoadsorção 3-5. Uma variedade de antigénios específicos já foram identificados 2,3 e anticorpos contra estes objectivos podem ser detectados por imunoensaios. No entanto, estes ensaios não pode discriminar entre o estímulo (ou seja funcionalmente eficaz) e bloqueio de auto-anticorpos. Há cada vez mais evice que esta distinção é 6,7 crucial. Pode também considerar-se que os objectivos estabelecidos para um certo número de anticorpos cardiotrópicos ainda não identificado e, portanto, não pode ser detectada por imunoensaios. Assim, foi estabelecido um método para a detecção de anticorpos funcionalmente activos cardiotrópicos, independentemente do seu antigénio correspondente. O pano de fundo para o método é a elevada homologia normalmente observada para as regiões funcionais de proteínas cardíacas em mamíferos entre 8,9. Isto sugere que os anticorpos dirigidos contra antigénios cardíacos humanos reagem de forma cruzada com as células-alvo não-humanos, o que permite o teste de IgG de pacientes com CMD em cardiomiócitos de ratos adultos. O nosso método consiste em três passos: primeiro, a IgG é isolada a partir de plasma de paciente com Sepharose acoplada anti-IgG de anticorpos obtidas a partir de colunas de imunoadsorção (PlasmaSelect, Teterow, Alemanha). Em segundo lugar, os cardiomiócitos adultos são isolados através de perfusão com colagenase num aparelho de perfusão Langendorff usando aprotocolo modificado de trabalhos anteriores 10,11. Os cardiomiócitos obtidos estão ligados a esfregaços laminina revestidos septadas e coradas com Fura-2, um corante fluorescente de cálcio selectivo que pode ser facilmente levado para dentro da célula para observar o cálcio intracelular (Ca2 +) conteúdo 12. No último passo, o efeito de IgG do paciente sobre a redução das células e os transientes de Ca 2 + de cardiomiócitos de campo estimulado é monitorizada utilizando uma linha de cálcio comercial miócito e contractilidade sistema de monitorização (IonOptix, Milton, MA, EUA), ligado a um padrão inverso fluorescente microscópio.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método apresentado oferece um modo adequado, para detectar auto-anticorpos funcionalmente eficazes cardíacos em pacientes com DCM de origem incerta. Em comparação com os outros métodos, por exemplo, a detecção de anticorpos funcionais activos contra o β1-adrenérgico por seu impacto sobre os níveis de cAMP 6, o nosso método é independente de um epitopo específico. Claro que há outros epítopos ensaios independentes descritos na literatura, ou seja, a taxa de contagem de cardio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Transregio Sonderforschungsbereich 19 (SFB/TR19, C2) da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), o Ministério Federal da Economia e Tecnologia projeto ZIM-KF 2727801MD0 e do Centro de Competência Inovação – respostas imunes humoral em Doenças Cardiovasculares ( ZIK CAMINHADA, BMBF FKZ 03Z2CN12) do Ministério Federal da Educação e Pesquisa, na Alemanha. Habitação e experimentos com animais foram realizados de acordo com as recomendações da Sociedade para Laboratory Animal Science (Gesellschaft für Versuchstierkunde, GV-SOLAS) e da Federação Europeia de Laboratório Animal Science Association (FELASA).
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Immunosorba preservation solution | Fresenius Medical Care | 903609211 | |
| Collagenase type 2 | Cell System | LS004176 | |
| BSA, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Fura-2 AM | Sigma-Aldrich | F0888 | 1 mg/ml in DMSO |
| Econo Pac Chromatography Columns | BioRad | 732-1010 | |
| Spectra/Por Biotech Cellulose Ester Dialysis Membrane | Spectrumlabs | 131417 | |
| 4 well Chambered Coverglass | Nunc | 155383 | |
| Myocyte Calcium and Contractility Recording System | IonOptix | ||
| IonWizard 6.0 analysis software | IonOptix |
References
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