Måling av antistoffer Effekter på cellulær funksjon av isolerte cardiomyocytes
Summary
Den presenterte fremgangsmåte tilbyr en måte å detektere funksjonelle effektive cardiotropic autoantistoffer i plasma av pasienter med dilatert kardiomyopati, uavhengig av den spesifikke antigen, ved å analysere effekten av isolert pasient immunoglobulin på cellulære matfett og intracellulære kalsium transienter i isolerte rotte cardiomyocytes.
Abstract
Dilatert kardiomyopati (DCM) er en av de viktigste årsakene til hjertesvikt hos yngre voksne en. Selv om genetisk disposisjon og eksponering for giftige stoffer er kjent årsaker til denne sykdommen hos omtrent en tredel av pasientene, forblir opprinnelsen DCM stor grad uklart. I et betydelig antall av disse pasientene har autoantistoffer mot hjerte-epitoper blitt oppdaget og er mistenkt for å spille en sentral rolle i utbruddet og progresjon av sykdommen 2,3. Betydningen av hjerte autoantistoffer understrekes av en hemodynamiske forbedring observert i DCM pasienter etter eliminering av autoantistoffer ved immunoadsorption 3-5. En rekke spesifikke antigener har allerede blitt identifisert 2,3 og antistoffer mot disse mål kan påvises ved immunoanalyser. Imidlertid kan disse analysene ikke diskriminere mellom å stimulere (og derfor funksjonelt effektive) og blokkerer autoantistoffer. Det er økende evidence at dette skillet er avgjørende 6,7. Det kan også antas at målene for en rekke cardiotropic antistoffer fortsatt uidentifiserte og kan derfor ikke bli detektert av immunoanalyser. Derfor etablerte vi en fremgangsmåte for påvisning av funksjonelt aktiv cardiotropic antistoffer, uavhengig av deres respektive antigen. Bakgrunnen for fremgangsmåten er den høye homologi vanligvis observeres for funksjonelle regioner kardiale proteiner i mellom pattedyr 8,9. Dette tyder på at kardiale antistoffer rettet mot humane antigener vil kryssreagere med ikke-humane målceller, noe som tillater testing av IgG fra DCM pasienter på voksen rotte cardiomyocytes. Vår metode består av 3 trinn: først, IgG isolert fra pasienten plasma med Sepharose coupled anti-IgG-antistoffer hentet fra immunoadsorption kolonner (PlasmaSelect, Teterow, Tyskland). Second, voksen cardiomyocytes er isolert etter collagenase perfusjon i en Langendorff perfusjon apparat med aprotocol endret fra tidligere arbeider 10,11. De oppnådde cardiomyocytes er festet til laminin-belagte Chambered coverglasses og farget med Fura-2, en kalsium-selektiv fluorescerende fargestoff som lett kan bringes inn i cellen for å observere intracellulær kalsium (Ca2 +) innholdet 12. I det siste trinnet, effekten av pasienten IgG på cellen matfett og Ca 2 + transienter av feltet stimulerte cardiomyocytes overvåkes elektronisk ved hjelp av en kommersiell myocyte kalsium og kontraktilitet overvåkingssystem (IonOptix, Milton, MA, USA) koblet til en standard invers fluorescerende mikroskop.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den presenterte fremgangsmåte tilbyr en egnet måte å oppdage funksjonelt effektive kardiale autoantistoffer i pasienter med DCM for uklar opprinnelse. I forhold til andre metoder, f.eks påvisning av funksjonelle aktive antistoffer mot β1-adrenoseptor ved deres innvirkning på cAMP nivåer 6, er vår metode uavhengig av en bestemt epitop. Selvfølgelig finnes det andre epitop uavhengige analyser beskrevet i litteraturen, dvs. telle slo frekvensen av neonatale cardiomyocytes 13,</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Sonderforschungsbereich Transregio 19 (SFB/TR19, C2) av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), den føderale departementet for økonomi og teknologi-prosjekt ZIM-KF 2727801MD0 og Senter for Innovasjon Kompetanse – humorale immunresponser i hjerte-og karsykdommer ( ZIK-tur, BMBF FKZ 03Z2CN12) av Federal Utdannings-og forskningsdepartementet, Tyskland. Bolig og eksperimenter med dyr ble utført i samsvar med anbefalingene fra Society for Laboratory Animal Science (Gesellschaft für Versuchstierkunde, GV-SOLAS) og Federation of European Laboratory Animal Science Association (FELASA).
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Immunosorba preservation solution | Fresenius Medical Care | 903609211 | |
| Collagenase type 2 | Cell System | LS004176 | |
| BSA, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Fura-2 AM | Sigma-Aldrich | F0888 | 1 mg/ml in DMSO |
| Econo Pac Chromatography Columns | BioRad | 732-1010 | |
| Spectra/Por Biotech Cellulose Ester Dialysis Membrane | Spectrumlabs | 131417 | |
| 4 well Chambered Coverglass | Nunc | 155383 | |
| Myocyte Calcium and Contractility Recording System | IonOptix | ||
| IonWizard 6.0 analysis software | IonOptix |
References
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics–2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18 (2011).
- Caforio, A. L., Vinci, A., Iliceto, S. Anti-heart autoantibodies in familial dilated cardiomyopathy. Autoimmunity. 41 (6), 462 (2008).
- Yoshikawa, T., Baba, A., Nagatomo, Y. Autoimmune mechanisms underlying dilated cardiomyopathy. Circ. J. 73 (4), 602 (2009).
- Felix, S. B., et al. Hemodynamic effects of immunoadsorption and subsequent immunoglobulin substitution in dilated cardiomyopathy: Three-month results from a randomized study. Journal of the American College of Cardiology. 35 (6), 1590 (2000).
- Staudt, A., et al. Role of immunoglobulin G3 subclass in dilated cardiomyopathy: results from protein A immunoadsorption. Am. Heart J. 150 (4), 729 (2005).
- Nikolaev, V. O., et al. A novel fluorescence method for the rapid detection of functional beta1-adrenergic receptor autoantibodies in heart failure. J. Am. Coll. Cardiol. 50 (5), 423 (2007).
- Jahns, R., et al. Autoantibodies activating human beta1-adrenergic receptors are associated with reduced cardiac function in chronic heart failure. Circulation. 99 (5), 649 (1999).
- Gocayne, J., et al. Primary structure of rat cardiac beta-adrenergic and muscarinic cholinergic receptors obtained by automated DNA sequence analysis: further evidence for a multigene family. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (23), 8296 (1987).
- Jaenicke, T., et al. The complete sequence of the human beta-myosin heavy chain gene and a comparative analysis of its product. Genomics. 8 (2), 194 (1990).
- Piper, H. M., Volz, A., Schwartz, P., Piper, H. M. . Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research. , (1990).
- Kubin, T., et al. Microvascular endothelial cells remodel cultured adult cardiomyocytes and increase their survival. Am. J. Physiol. 276 (6 Pt. 2), H2179 (1999).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260 (6), 3440 (1985).
- Magnusson, Y., et al. Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization of antibodies against the beta 1-adrenoceptor with positive chronotropic effect. Circulation. 89 (6), 2760 (1994).
- Wakefield, I. D., et al. The application of in vitro methods to safety pharmacology. Fundam. Clin. Pharmacol. 16 (3), 209 (2002).
- Kajzar, A., et al. Toward physiological conditions for cell analyses: forces of heart muscle cells suspended between elastic micropillars. Biophys. J. 94 (5), 1854 (2008).
