Profiling glicana de Polímeros da planta da parede celular usando Microarrays
Summary
Uma técnica chamada<strong> C</strong> Omprehensive<strong> M</strong> Icroarray<strong> P</strong> Profiling olymer (CoMPP) para a caracterização de glicanos da parede celular vegetal é descrito. Este método combina a especificidade dos anticorpos monoclonais dirigidos para epitopos definidos glicano-com uma plataforma de microarray em miniatura analítico permitindo rastreio de ocorrência de glicano em uma ampla variedade de contextos biológicos.
Abstract
Paredes das células de planta são matrizes complexas de glicanos heterogéneos, que desempenham um papel importante na fisiologia e desenvolvimento de plantas e fornecer as matérias-primas para as sociedades humanas (por exemplo, as indústrias de madeira, papel, têxteis, e biocombustíveis) 1,2. No entanto, compreender a biossíntese e função destes componentes permanece um desafio.
Glicanos de parede celular são quimicamente e conformacionalmente diversificada, devido à complexidade dos blocos de construção, os resíduos glicosilo. Estas ligações formam em posições múltiplas e diferem na estrutura do anel, a configuração isomérica ou anomérico, e, além disso, são substituídas por uma matriz de não-açúcar resíduos. Composição varia de glicano na célula diferente e / ou tipos de tecidos, ou mesmo sub-domínios de uma única célula de parede 3. Além disso, a sua composição é também modificado durante o desenvolvimento 1, ou em resposta a estímulos ambientais 4.
Em excesso de 2.000 genes têm paredes celulares de plantas são matrizes complexas de glicanos heterogéneas foram previstos para ser envolvido na biossíntese de glicanos parede celular e modificação em 5 Arabidopsis. No entanto, relativamente poucos dos genes biossintéticos foram funcionalmente caracterizados 4,5. Genética reversa são difíceis porque os genes expressos diferencialmente são muitas vezes, muitas vezes em níveis baixos, entre os tipos de células 6. Além disso, estudos mutantes são muitas vezes dificultada pela redundância gene ou mecanismos compensatórios para garantir o funcionamento adequado parede celular é mantida 7. Assim, novas abordagens são necessárias para rapidamente caracterizar a diversidade de estruturas de glicano e facilitar abordagens genômica funcional para a compreensão a síntese da parede celular e modificação.
Os anticorpos monoclonais (mAb) 8,9 surgiram como uma ferramenta importante para a determinação da estrutura de glicano e distribuição nas plantas. Estes reconhecem distepítopos INCT presentes dentro das principais classes de glicanos da parede celular vegetal, incluindo pectinas, xiloglucanos, xilanos, mananos, glucanos e Arabinogalactanos. Recentemente o seu uso tem sido estendido para experiências em grande escala de triagem para determinar a abundância relativa de glicanos em uma ampla gama de tipos de tecido da planta e, simultaneamente, 9,10,11.
Apresentamos aqui um microarray-based método de rastreio de glicano chamado Comprehensive Polymer Microarray Profiling (CoMPP) (Figuras 1 & 2) 10,11, que permite múltiplas amostras (100 s) a ser rastreada utilizando uma plataforma de microarray miniaturizado com o reagente reduzida e os volumes de amostra. Os sinais no local de microarray pode ser formalmente quantificadas para dar semi-quantitativas de dados sobre a ocorrência de glicano epítopo. Esta abordagem é bem adequado para o rastreamento de alterações glicano em sistemas biológicos complexos 12 e proporcionando uma visão global da composição da parede celular particularmente quando o conhecimento préviof este não está disponível.
Protocol
Representative Results
Discussion
CoMPP é um método rápido e sensível para perfilar a composição de glicano de centenas de plantas derivadas de amostras em uma questão de dias. Este método complementa os já disponíveis bacterianas ou de mamíferos plataformas de matriz de glicano para rastreio de alto rendimento de interacções de hidratos de carbono com glicano de proteínas de ligação, tais como lectinas, receptores e anticorpos 16. Com uma grande diversidade de testes disponíveis para a detecção de glicanos da parede celula…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IEM gostaria de reconhecer o dinamarquês Research Council (FTP e FNU) para financiamento. ERL reconhece o apoio de uma DP ARC subvenção. AB agradece o apoio do Centro de Excelência em ARC Usina concessão paredes celulares.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 3 mm Tungsten Carbide beads | Qiagen | 69997 | |
| Collection microtubes (1.2 mm) | Qiagen | 19560 | 1.5 ml microfuge tubes can also be used |
| Qiagen TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| 3 mm glass beads | Sigma Aldrich | Z143928 | |
| CDTA | Sigma Aldrich | 34588 | |
| Cadmium oxide | Sigma Aldrich | 202894 | |
| 1,2-diaminoethane | Sigma Aldrich | 03550 | |
| Nitrocellulose membrane (0.22 μm pore size) | GE-water & process technologies | EP2HY00010 | different pore sized membranes are suitable for different pin types |
| Xact II microarrayer robot | Labnext | 001A | the Xact II robot was fitted with a custom 20 x 20 cm ceramic plate to which the nitrocellulose membrane is attached |
| Xtend RM microarray pins | Labnext | 0037-350 | pins must be suitable for spotting on membranes |
| 384 well microtiter plates (polypropylene) | Greiner | 781207 | |
| Anti-glycan monoclonal antibodies | Plant Probes/ CarboSource/Biosupplies |
Websites; PlantProbes (www.plantprobes.net), Carbosource (www.carbosource.net) and Biosupplies (www.biosupplies.com.au). | |
| Anti-Rat IgG (whole molecule) – Peroxidase antibody produced in goat. | Sigma | A9037 | the type of secondary antibodies depends on the primary antibody used (e.g. raised in rat, mouse, goat etc). |
| SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | the type of developing reagent depends on the secondary antibodies used and the detection method (colourmetric, or chemiluminecent). |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermoscientific | 34080 | see above |
| Xplore Image Processing Software | LabNext | 008 | many software types with automatic gridding tools are available to measure pixel value of microarray spots. |
| Plant polysaccharides | Sigma/Megazyme |
References
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