전체 세포 인구의 단일 셀 수준에서 Cyclin B의 Proteolysis 유학
Summary
전환이 anaphase-추진 단지 (APC / C)에 의존 ubiquitination과 여기 cyclin B.의 후속 파괴를, 우리는, 펄스 – 체이스 라벨에 따라, 시스템을 설립 전체 세포 인구에서 cyclin B의 proteolysis를 모니터링 할 수 있으며를 통해 실행됩니다 anaphase에 Metaphase mitotic 검문소에 의한 간섭의 검색을 용이하게한다.
Abstract
세포 분열 동안 두 딸 세포 사이의 염색체의 동등한 배포 유전자 안정성 1 보장을위한 전제 조건입니다. 염색체 분리시 부정확 한이 종의 특징이며 진행성 질환 2-4와 관련된. 스핀들 조립 검사 점 (SAC)는 모든 단일 염색체는 mitotic 스핀들 1 안정적인 바이폴라 첨부 파일을 확립 할 때까지 다시 metaphase에서 세포를 보유하고 mitotic 감시 메커니즘입니다. SAC는 활성화와 간섭에 의해 그 기능을 발휘 APC / C securin와 cyclin B의 proteolysis하므로 염색체 분리와 mitotic 출구를 차단하는 subunit Cdc20. 염색체의 부적절한 첨부 파일 SAC 신호의 입을 방지하고 문제가 염색체 missegregation, aneuploidy와 악성 growths 일을 피하기 위해 해결 될 때까지 APC / C Cdc20의 지속적인 억제가 발생합니다.
내가 연설을 대부분의 연구APC / C에 의존 proteolysis에 부적절한 염색체 첨부 파일의 nfluence는 미소로 염색체 첨부 파일을 방해하는 약물을 depolymerizing 또는 미세 소관 – 안정화를 사용하여 스핀들 혼란을 이용했다. 미세 소관의 동력학과 간섭이 교통 및 중요한 규제의 국산화에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 이러한 절차는 인공 효과, 5를 일으킬 위험을 맺습니다.
SAC는에서 유사 분열 동안 APC / cyclin B의 C-의존 proteolysis을 방해하는 방법 공부하는 세포 집단을 교란되지 않은, 우리는 허용 히스톤 H2-GFP-기반 시스템을 설립 metaphase mitotic 염색체의 정렬 및 cyclin B 6 proteolysis의 동시 모니터링 .
proteolytic 프로필을 묘사하기 위해, 우리는 C-터미널 SNAP 잔기 6 (그림 1) 키메라 cyclin의 B 기자 분자를 생성. 자체 라벨 반응에서 SNAP-잔기가 함께 공유 결합 채권을 형성 할 수 있습니다alkylguanine – 반송파 (SNAP 기판) 7,8 (그림 1). SNAP 기판 분자 쉽게 사용할 수 있으며 다른 fluorochromes의 폭 넓은 스펙트럼을 가지고 다니십시오. 키메라 cyclin B-SNAP 분자는 성장 매체 7 (그림 1)에 막 투과성 SNAP 기판의 추가에 표시됩니다. 라벨 반응 후, cyclin B-SNAP 형광 강도는 펄스 추격전 반응과 같은 방식으로 형광 강도 cyclin B 저하 6 (그림 1)의 수준을 반영에 떨어. Google 시스템은 병렬 셀 (또는 여러 세포 집단)의 큰 숫자 mitotic APC / C에 의존 proteolysis의 모니터링을 용이하게한다. 따라서, 시스템은 에이전트 / 전환을 anaphase 할 metaphase에서 proteolytic 활동을 방해 할 수있는 작은 분자를 식별 할 수있는 귀중한 도구가 될 수 있습니다. 또한, 유사 분열 동안 cyclin B의 합성으로 최근 중요한 mechanis으로 제안 된안정적인 cyclin B 표현 수준 9,10를 유지하여 마우스와 인간의 mitotic 블록을 조성하는데있어,이 시스템은 우리가 균형 잡힌 평형 6 항 중 어느 한 요소로 cyclin의 B의 proteolysis를 분석 할 수있게.
Protocol
Discussion
우리는 여기 cyclin B의 proteolysis 및 염색체 정렬의 동시 모니터링을 용이하게 라이브 셀 이미징 기반의 접근 방식을 제시한다. 이 방법은에서 mitotic 컨트롤의 연구는 단일 세포 수준에서 세포 인구를 교란되지 않은 수 있습니다. Cyclin B 저하 곡선은 APC / C의 활동에 직접 통찰력을 촉진하므로 간접적으로 SAC 6의 상태를 반영합니다.
이 방법은 비록 스캔 ^ R 소프트웨어를 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 pLPCX-히스톤 H2-GFP 플라스미드를 제공 S. 테일러에게 감사합니다. 우리는 지속적인 지원 R. Mertelsmann 감사드립니다. 이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of product | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Reporter cell line | generated in-house as described 6 | clone 11 reporter cells (U2Os-based cyclin B-SNAP expressing cells) |
|
| Retroviral cyclin B-SNAP expression vector | generated in-house as described 6 | pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP | |
| Phenolred-free DMEM | Gibco | 21063-029 | Supplementation with FCS, sodium pyruvate, penicillin/strepto-mycin required |
| SNAP-Cell TMR-Star | New England Biolabs | S9105S | Stock solution 400 μM in DMSO |
| Special Opstics Plate, 96 well | Costar | 3720 | |
| μ-Slide 8 well, ibiTreat | Ibidi | 80826 | |
| Microscopy unit | Olympus | IX-81 inverse microscope with climate chamber | |
| Objective | Olympus | UPLSAPO 20x objective (N.A. 0.75) | |
| Acquisition software | Olympus | Scan^R Acquisition software (v.2.2.09) | |
| Analysis software | Olympus | Scan^R Analysis software (v.1.2.0.6) |
References
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