Et assay for permeabilitet af zebrafisk Embryonic Neuroepithelium
Summary
Vi beskriver en levende hele dyr kvantitativ måling for permeabiliteten af den embryoniske zebrafisk hjernen. Teknikken analyserer evnen til at fastholde cerebrospinalvæske og molekyler med forskellige molekylvægte i de neurale rør lumen og kvantificerer deres bevægelse ud af ventriklerne. Denne metode er nyttig til bestemmelse af forskelle i epitel permeabilitet og modning under udvikling og sygdom.
Abstract
Hjernen ventrikulære system er bevaret blandt hvirveldyr og består af en række indbyrdes forbundne hulrum kaldet hjerneventriklerne, som dannes under de tidligste stadier af hjernens udvikling og vedligeholdes hele dyrets liv. Hjernen ventrikulære system findes i hvirveldyr, og hjertekamrene udvikles efter neuralrøret formation, når den centrale lumen fyldes med cerebrospinalvæske (CSF) 1,2. CSF er en proteinrig væske, der er vigtig for normal hjernens udvikling og funktion 3-6.
I zebrafisk, begynder hjerneventriklen inflation på cirka 18 timer efter befrugtning (HPF), efter at neuralrøret er afsluttet. Flere processer er forbundet med hjerneventriklen dannelse, herunder dannelse af en neuroepithelium, tight junction formation, der regulerer permeabiliteten og CSF-produktion. Vi viste, at Na, K-ATPase kræves for hjerneventriklen inflation, der påvirker alle disse proceses 7,8, mens claudin 5a er nødvendig for tight junction dannelse 9. Desuden har vi vist, at "afslapning" af den embryoniske neuroepithelium, via inhibering af myosin, er forbundet med hjerneventriklen inflation.
For at undersøge reguleringen af permeabilitet i løbet af zebrafisk hjerneventriklen inflation har vi udviklet en ventrikulær farvestof tilbageholdelse assay. Denne metode anvender hjerneventriklen injektion i en levende zebrafisk embryo, en teknik der tidligere udviklet i vores laboratorium 10, til fluorescens mærke cerebrospinalvæsken. Embryoner derefter afbildet over tid som det fluorescerende farvestof bevæger sig gennem hjerneventriklerne og neuroepithelium. Afstanden farvefronten bevæger sig væk fra den basale (ikke-luminal) side af neuroepithelium over tid kvantificeres og er et mål for neuroepitelceller permeabilitet (fig. 1). Vi bemærker, at farvestoffer 70 kDa, og mindre vil bevæge sig gennem neuroepithelium og kan være detected udenfor den embryoniske zebrafisk hjernen ved 24 HPF (figur 2).
Dette farvestof retention assay kan anvendes til at analysere neuroepitelceller permeabilitet i en række forskellige genetiske baggrunde, på forskellige tidspunkter under udviklingen, og efter miljømæssige forstyrrelser. Det kan også være nyttige ved behandlingen af patologiske akkumulering af CSF. Samlet set denne teknik gør det muligt for efterforskerne at analysere den rolle og regulering af permeabilitet under udvikling og sygdom.
Protocol
Discussion
Vi demonstrerer evnen til at kvantificere permeabiliteten af den levende embryonale zebrafisk hjerne som bestemt for et injicerbart farvestof af en given molekylvægt. Vores observation, at det embryoniske zebrafisk neuroepithelium er differentielt gennemtrængeligt for farvestoffer med forskellige molekylvægte tyder på, at farvestoffet bevæger sig via paracellulær permeabilitet. Men vi kan ikke udelukke muligheden af en transcellulær bidrag til den observerede permeabilitet. Denne teknik kan anvendes p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Institute for Mental Health, og National Science Foundation. Særlig tak til SIVE lab medlemmer til mange nyttige diskussioner og konstruktiv kritik, og til Olivier Paugois til sagkyndig fisk dyrehold.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue number |
| Dextran, Fluorescein, Anionic, Lysine Fixable | Invitrogen | D7136, D7137, D1822, D1820, D1845 |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
References
- Harrington, M. J., Hong, E., Brewster, R. Comparative analysis of neurulation: first impressions do not count. Mol. Reprod. Dev. 76, 954-965 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Strategies of vertebrate neurulation and a re-evaluation of teleost neural tube formation. Mech. Dev. 121, 1189-1197 (2004).
- Salehi, Z., Mashayekhi, F. The role of cerebrospinal fluid on neural cell survival in the developing chick cerebral cortex: an in vivo study. Eur. J. Neurol. 13, 760-764 (2006).
- Martin, C. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. Int. J. Dev. Neurosci. 27, 733-740 (2009).
- Lehtinen, M. K. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69, 893-905 (2011).
- Gato, A. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 284, 475-484 (2005).
- Lowery, L. A., Sive, H. Totally tubular: the mystery behind function and origin of the brain ventricular system. Bioessays. 31, 446-458 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Zhang, J. Establishment of a neuroepithelial barrier by Claudin5a is essential for zebrafish brain ventricular lumen expansion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1425-1430 (2010).
- Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish brain ventricle injection. J. Vis. Exp. , (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M., Sprague, J., Doerry, E., Douglas, S., Grp, Z. The Zebrafish Information Network (ZFIN): a resource for genetic, genomic and developmental research. Nucleic Acids Research. 29, 87-90 (2001).
