Ein Assay zur Durchlässigkeit des Zebrafisch-Embryos Neuroepithel
Summary
Wir beschreiben eine Live ganze Tier quantitative Messung für die Durchlässigkeit des embryonalen Zebrafischgehirn. Die Technik analysiert die Fähigkeit, Zerebrospinalflüssigkeit und Moleküle unterschiedlichen Molekulargewichts in den neuronalen Schlauchlumen behalten und quantifiziert ihre Bewegung aus der Ventrikel. Diese Methode ist nützlich zur Bestimmung von Unterschieden in epithelialen Permeabilität und Reifung in der Entwicklung und Krankheit.
Abstract
Das Gehirn ventrikuläre System unter den Wirbeltieren konserviert und besteht aus einer Reihe von miteinander verbundenen Hohlräumen Hirnkammern genannt, die in den frühesten Stadien der Entwicklung des Gehirns bilden und während der gesamten Lebensdauer des Tieres aufrechterhalten zusammengesetzt. Das Gehirn ventrikuläre System ist in Wirbeltieren, und die Ventrikel zu entwickeln, nachdem Neuralrohr Formation, wenn das zentrale Lumen mit Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) 1,2 ausfüllt. CSF ist eine proteinreiche Flüssigkeit, die wichtig für die normale Entwicklung des Gehirns und Funktion 3-6 ist.
Im Zebrafisch, beginnt Hirnventrikel Inflation bei etwa 18 Stunden nach der Befruchtung (HPF), nachdem das Neuralrohr ist geschlossen. Mehrere Prozesse sind mit Hirnventrikel Bildung, einschließlich Bildung einer Neuroepithels, tight junction Formation, die Durchlässigkeit und CSF-Produktion reguliert verbunden. Wir haben gezeigt, dass die Na, K-ATPase für Hirnventrikel Inflation erforderlich ist, beeinflussen alle diese Verfahrenes 7,8, während Claudin 5a notwendig tight junction Bildung 9 ist. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass "Entspannung" der embryonalen Neuroepithels, über eine Hemmung der Myosin, ist mit Hirnventrikel Inflation verbunden.
Um die Regulation der Permeabilität im Zebrafisch Hirnventrikel Inflation zu untersuchen, entwickelten wir eine ventrikuläre Farbstoffretention Assay. Diese Methode verwendet Hirnventrikel Injektion in einem lebenden Zebrafisch-Embryos, eine Technik zuvor in unserem Labor 10 entwickelt, um Fluoreszenz-Markierung der Liquor. Embryonen werden dann im Laufe der Zeit den fluoreszierenden Farbstoff bewegt sich durch die Hirnkammern und Neuroepithel abgebildet. Der Abstand der Farbstoff vorne bewegt sich weg von der basalen (nicht-luminalen) Seite des Neuroepithel über die Zeit quantifiziert und ist ein Maß für neuroepithelialen Permeabilität (Abbildung 1). Wir beobachten, dass Farbstoffe 70 kDa und kleiner wird durch die Neuroepithel bewegen und kann detected außerhalb des embryonalen Zebrafischgehirn bei 24 hpf (Abbildung 2).
Dieser Farbstoff Retention Assay kann verwendet werden, um neuroepithelialen Permeabilität in einer Vielzahl von unterschiedlichen genetischen Hintergründen zu analysieren, zu verschiedenen Zeiten während der Entwicklung, und nach ökologischen Störungen. Es kann auch nützlich sein bei der Prüfung pathologischen Anhäufung von CSF. Insgesamt ermöglicht diese Technik die Ermittler, um die Rolle und Regulierung der Durchlässigkeit während der Entwicklung und Krankheit zu analysieren.
Protocol
Discussion
Wir zeigen die Fähigkeit, die Durchlässigkeit des lebendigen embryonalen Zebrafischgehirn quantifizieren, da für eine injiziert Farbstoff einem bestimmten Molekulargewicht bestimmt. Unsere Beobachtung, dass die embryonale Zebrafisch Neuroepithel differentiell durchlässig Farbstoffe mit unterschiedlichen Molekulargewichten ist nahe, dass der Farbstoff über die parazelluläre Permeabilität zu bewegen. Wir können jedoch nicht ausschließen, die Möglichkeit einer transzellulären Beitrag zur beobachteten Durchlässi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Institute for Mental Health und der National Science Foundation unterstützt. Besonderer Dank geht an Sive lab Mitglieder für viele hilfreiche Diskussionen und konstruktive Kritik, und Olivier Paugois für Experten Fische Tierhaltung.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue number |
| Dextran, Fluorescein, Anionic, Lysine Fixable | Invitrogen | D7136, D7137, D1822, D1820, D1845 |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
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