Un ensayo para la permeabilidad del neuroepitelio embrionario de pez cebra
Summary
Se describe una medición vivo animal entero cuantitativo para la permeabilidad del cerebro embrionario de pez cebra. La técnica analiza la capacidad de retener el líquido cefalorraquídeo y moléculas de diferentes pesos moleculares dentro del lumen del tubo neural y cuantifica su movimiento de salida de los ventrículos. Este método es útil para determinar las diferencias en la permeabilidad epitelial y maduración durante el desarrollo y la enfermedad.
Abstract
El sistema ventricular del cerebro se conserva entre los vertebrados, y se compone de una serie de cavidades interconectadas llamado ventrículos del cerebro, que se forman durante las primeras etapas del desarrollo del cerebro y se mantienen durante toda la vida del animal. El sistema ventricular del cerebro se encuentra en los vertebrados, y los ventrículos se desarrollan después de la formación del tubo neural, cuando el lumen central se llena con fluido cerebroespinal (CSF) 1,2. CSF es un fluido rico en proteínas que es esencial para el desarrollo normal del cerebro y la función 3-6.
En el pez cebra, la inflación cerebro ventrículo comienza a aproximadamente 18 horas después de la fertilización (hpf), después de que el tubo neural se cierra. Varios procesos están relacionados con la formación del cerebro ventrículo, incluida la formación de un neuroepitelio, la formación de uniones estrechas que regula la permeabilidad y la producción de LCR. Hemos demostrado que la Na, K-ATPasa se requiere para la inflación ventrículo cerebral, afectando todos estos procesoses 7,8, mientras que claudin 5a es necesario para la formación de la unión estrecha 9. Además, se demostró que "relajación" del neuroepitelio embrionario, a través de la inhibición de la miosina, se asocia con la inflación cerebro ventrículo.
Para investigar la regulación de la permeabilidad durante la inflación pez cebra ventrículo cerebral, hemos desarrollado un medio de contraste ventricular ensayo de retención. Este método utiliza la inyección ventrículo cerebral en un embrión de pez cebra de estar, una técnica desarrollada anteriormente en nuestro laboratorio 10, para etiquetar fluorescentemente el líquido cefalorraquídeo. Los embriones son entonces fotografiado con el tiempo a medida que el tinte fluorescente a través de los ventrículos cerebrales y el neuroepitelio. La distancia que el frente del colorante se aleja de la basal (no luminal) lado del neuroepitelio con el tiempo se cuantifica y es una medida de la permeabilidad neuroepitelial (Figura 1). Observamos que los colorantes de 70 kDa y más pequeñas se mueven a través del neuroepitelio y puede ser detected fuera del cerebro embrionario de pez cebra a las 24 HPF (Figura 2).
Este ensayo de retención de colorante puede ser utilizado para analizar la permeabilidad neuroepitelial en una variedad de diferentes antecedentes genéticos, en diferentes momentos durante el desarrollo, y después de las perturbaciones ambientales. También puede ser útil en el examen acumulación patológica de CSF. En general, esta técnica permite a los investigadores a analizar la función y la regulación de la permeabilidad durante el desarrollo y la enfermedad.
Protocol
Discussion
Se demuestra la capacidad de cuantificar la permeabilidad del cerebro embrionario de pez cebra vivo tal como se determina por un medio de contraste inyectado de un peso molecular dado. Nuestra observación de que el neuroepitelio embrionario de pez cebra es diferencialmente permeable a los tintes de diferentes pesos moleculares sugiere que el colorante se está moviendo a través de la permeabilidad paracelular. Sin embargo, no podemos descartar la posibilidad de una contribución a la permeabilidad transcelular observa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud Mental, y la National Science Foundation. Un agradecimiento especial a los miembros del laboratorio Sive para muchas discusiones útiles y críticas constructivas, ya Olivier Paugois para la cría de peces experto.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue number |
| Dextran, Fluorescein, Anionic, Lysine Fixable | Invitrogen | D7136, D7137, D1822, D1820, D1845 |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
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