Un dispositif microfluidique pour l'étude de plusieurs souches distinctes
Summary
Nous présentons une méthode simple pour produire des dispositifs microfluidiques capables d'appliquer les mêmes conditions dynamiques à plusieurs souches distinctes, sans avoir besoin d'une salle blanche ou lithographie douce.
Abstract
L'étude des réponses cellulaires aux changements environnementaux pose de nombreux défis expérimentaux: les cellules doivent être imagé dans des conditions changeantes, souvent de manière comparative. Plaques multipuits sont couramment utilisées pour comparer différentes souches ou des lignées cellulaires, mais de permettre un contrôle limité sur la dynamique de l'environnement. Dispositifs microfluidiques, d'autre part, de permettre exquise contrôle dynamique des conditions environnantes, mais il est difficile d'image et de distinguer plus de quelques souches en eux. Nous décrivons ici une méthode pour fabriquer facilement et rapidement un dispositif microfluidique capable d'appliquer les conditions changent dynamiquement à de multiples souches de levures différentes dans un même canal. L'appareil est conçu et fabriqué par des moyens simples, sans la nécessité d'une lithographie douce. Il se compose d'un canal d'écoulement en forme de Y attaché à une seconde couche hébergeant micropuits. Les souches sont placés dans des micropuits distincts, et imagée dans exactement les mêmes conditions dynamiques. Nous démonstrate l'utilisation du dispositif de mesure de la localisation des protéines réponses à des impulsions de changement de nutriments dans différentes souches de levure.
Introduction
Les cellules sont constamment réagir à un environnement changeant dynamiquement, en changeant leur métabolisme, profil transcriptionnel et fonctions cellulaires. Pour étudier ces phénomènes, les méthodes qui permettent de quantifier ces changements sont nécessaires. Un type de lecture de ces réponses est le changement dans la localisation des facteurs de stress liés à la transcription en réponse à un stress nutritionnel.
Dispositifs de microfluidique 1 ont été utilisés pour manipuler dynamiquement des conditions environnementales dans les cellules 2-4. Ils présentent plusieurs avantages pour l'imagerie de cellules vivantes: l'environnement des cellules peuvent être contrôlées avec précision et dynamique a changé, les cellules peuvent être imagée en direct à tout moment, y compris lors de la manipulation des conditions extérieures, et des volumes de réactifs minimales sont requises. Une conception très simple pour un dispositif microfluidique, permettant une alternance entre deux conditions, est un dispositif en forme de Y 2. Nous utilisons régulièrement en forme de Y dispositifs microfluidiques qui permettentapplication des changements dynamiques aux cellules dans le canal. Nous utilisons ce dispositif pour suivre les changements de localisation des facteurs de stress marquées par fluorescence de transcription liés à des cellules de levure. Nous suivons ces changements dans l'évolution des conditions nutritionnelles. Par exemple, nous pouvons fournir une impulsion (ou une série d'impulsions) de glucose milieu contenant dans un délai de plus de glucose et moyen terme, à une résolution temporelle très fine. Souvent, dans ces expériences, on est intéressé à comparer les réponses des souches cellulaires différentes (par exemple, différents mutants ou différents isolats sauvages). Le canal en forme de Y est limitée à une souche dans chaque canal – si plus d'une souche est utilisé, il n'existe pas de moyen simple de faire la distinction entre les souches. Pour remédier à cela, les différents canaux peuvent être utilisés. Si nous voulons appliquer les mêmes conditions dynamiques de plusieurs souches, nous tenons à associer le concept Y-canal avec de multiples canaux. Il ya deux défis dans la mise en œuvre de cette solution: Il peut être difficile d'appliquer til mêmes conditions en même temps à tous les canaux, et il existe une limitation géométrique au nombre de canaux en Y qui peuvent être montés dans un seul appareil. Nous avons donc cherché un moyen pour visualiser plusieurs souches dans un canal dans des conditions dynamiques.
Ici, nous décrivons un dispositif à deux couches microfluidique destiné aux souches d'imagerie multiples dans un canal dans les mêmes conditions dynamiques. La couche inférieure est constituée de couches minces PDMS avec une rangée de trous. Cette couche est attachée à la lamelle de verre créant des puits dans lequel nous allons placer les différentes souches, les faire adhérer à la concanavaline A sur le verre. La seconde couche est un dispositif en forme de Y microfluidique créé en utilisant la méthode du ruban adhésif 5. Après avoir placé les souches dans les puits de la seconde couche est rapidement alignée et fixée à la première, la création d'une chaîne de plusieurs puits qui contiennent les différentes souches. Ce dernier dispositif permet de suivre plusieurs souches dans un canal, où tous lessouches sont soumis aux mêmes conditions à la même heure. Toute la conception et de la production qui peut être fait sur la paillasse, avec des moyens simples, sans la lithographie douce.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, nous présentons une méthode de paillasse simple pour créer un dispositif microfluidique qui permet suivants souches de levures plusieurs simultanément dans des conditions dynamiques. Après plusieurs souches dans un canal fournit un outil fiable pour comparer la dynamique des réponses des cellules individuelles dans des souches multiples. Un avantage de notre approche est la capacité à fabriquer le dispositif avec des techniques simples, sans la nécessité d'une salle blanche. En fait, nous…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
YG est soutenu par une bourse de la BID. IN est un garçon Alon et membre du corps professoral du Edmond J. Safra Center for Bioinformatics Université de Tel Aviv . Cette recherche a été financée par l'ISF subvention 1499/10.
Materials
| Reagent/Equipment | Company | Catalogue number |
| PDMS- SYLGARD 184 | Dow Corning USA | |
| Vacuum desiccator | Nalgene | 5310-0250 |
| Biopsy punchers | Ted Pella Inc. | Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15074 (1.2 mm) |
| Syringe pumps | Chemyx | Fusion 200 |
| Corona treater | Electro-technic products | BD-20 |
| Tygon tubing | Tygon | S-54-HL |
| Concanavalin-A | Sigma | C7275 |
| Scotch tape | 3M Scotch | Transparent Tape 1/2″ |
References
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