Udforskning arteriernes glatte muskulatur Kv7 kaliumkanal Funktion hjælp Patch Clamp Elektrofysiologi og Pressure Myography

Summary

Målinger af Kv7 (KCNQ) kalium kanal aktivitet i isolerede arterielle myocytter (ved hjælp af patch clamp elektrofysiologiske teknikker) parallelt med målinger af kvælerslange / dilator reaktioner (med tryk myography) kan afsløre vigtige oplysninger om de roller, Kv7 kanaler i vaskulære glatte muskulatur fysiologi og farmakologi.

Abstract

Kontraktion eller relaksation af glatte muskelceller i væggene i modstandskar bestemmer arteriediameteren og derved styrer strømmen af ​​blod gennem karret og bidrager til det systemiske blodtryk. Kontraktionen Processen reguleres primært af cytosolisk calciumkoncentration ^{([Ca2 +]} _cyt), som igen styres af en række forskellige ion-transportører og kanaler. Ionkanaler er almindelige mellemprodukter i signaltransduktionsveje aktiveres af vasoaktive hormoner for at bevirke vasokonstriktion eller vasodilatation. Og ionkanaler er ofte ramt af terapeutiske midler enten bevidst (f.eks kalciumblokkere anvendes til at fremkalde vasodilatation og lavere blodtryk) eller utilsigtet (f.eks at fremkalde uønskede kardiovaskulære bivirkninger).

Kv7 (KCNQ) spænding-aktiverede kaliumkanaler er for nylig blevet impliceret som vigtige fysiologiske og terapeutiske Targets for regulering af glatte muskelkontraktion. For at belyse de specifikke roller Kv7 kanaler i både fysiologiske signaltransduktion og i aktionerne af terapeutiske midler, er vi nødt til at undersøge, hvordan deres aktivitet moduleres på celleniveau samt vurdere deres bidrag inden for rammerne af det intakte arterie.

Rotte mesenteriske arterier et nyttigt modelsystem. Arterierne kan let dissekeres, renses for bindevæv, og anvendt til fremstilling af isolerede arterielle myocytter til patch-clamp-elektrofysiologi, eller kanyle og sættes under tryk for målinger af vasokonstriktor / vasodilator reaktioner under relativt fysiologiske betingelser. Her beskriver vi de metoder, der anvendes til begge typer af målinger og give nogle eksempler på, hvordan det eksperimentelle design kan integreres til at give en bedre forståelse af de roller, disse ionkanaler i reguleringen af ​​vaskulær tonus.

Protocol

1. Kirurgisk excision af tyndtarmens Mesenterial Vaskulær Arcade Bedøve en 300-400 g Sprague-Dawley-rotte med isofluran (4%) administreres ved inhalation. Udfør en midtlinie laparotomi at eksponere tyndtarmens mesenterium. Exteriorize den lille og store tarmen gennem abdominal incision med stor omhu for at undgå traumer på udsatte tarm og mesenterium. Forsigtigt lufte mesenteriet ud over steril gaze. Kirurgisk punktafgiftspligtige tyndtarmen og en del af tyktarmen, herunder caecum (bl…

Discussion

De metoder og eksperimentelle metoder beskrevet her er ganske robust og kan producere klare og reproducerbare resultater, når de anvendes med omhyggelig opmærksomhed på detaljer. Gode ​​elektrofysiologiske optagelser og konstriktion / dilatation af arterielle segmenter er afhængige af sundhed celler og arterie segmenter, hhv. Cellepræparater kan variere fra dag til dag, selv efter samme protokol. Isolation Solutions kan anvendes i op til 2 uger, men hvis kvaliteten af ​​cellen præparatet er lav af to deraf…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma	S5886	Dissecting Solution: 145 Bath solution for Electrophysiology*: 140 Internal solution for electrophysiology: 10 Isolation solution for myocytes*: 140 Bath solution for pressure myography: 145 Lumen solution for pressure myography: 145
Potassium chloride	Sigma	P5405	Dissecting Solution: 4.7 Bath solution for Electrophysiology*: 5.36 Internal solution for electrophysiology: 135 Isolation solution for myocytes*: 5.36 Bath solution for pressure myography: 4.7 Lumen solution for pressure myography: 4.7
Potassium EGTA	Sigma	E4378	Internal solution for electrophysiology: 0.05
HEPES	Sigma	H9136	Bath solution for Electrophysiology*: 10 Internal solution for electrophysiology: 10 Isolation solution for myocytes*: 10
Disodium hydrogen phosphate	Sigma	S5136	Isolation solution for myocytes*: 0.34
Potassium hydrogen phosphate	Sigma	P5655	Isolation solution for myocytes*: 0.44
Magnesium Chloride	Sigma	M2393	Bath solution for Electrophysiology*: 1.2 Internal solution for electrophysiology: 1 Isolation solution for myocytes*: 1.2
Calcium Chloride	Sigma	C7902	Bath solution for Electrophysiology*: 2 Isolation solution for myocytes*: 0.05
Sodium phosphate	Fisher Scientific	BP331-1	Dissecting Solution: 1.2 Bath solution for pressure myography: 1.2 Lumen solution for pressure myography: 1.2
Magnesium Sulfate	Sigma	M2643	Dissecting Solution: 1.17 Bath solution for pressure myography: 1.17 Lumen solution for pressure myography: 1.17
MOPS	Fisher Scientific	BP308	Dissecting Solution: 3 Bath solution for pressure myography: 3 Lumen solution for pressure myography: 3
Pyruvic acid	Sigma	P4562	Dissecting Solution: 2 Bath solution for pressure myography: 2 Lumen solution for pressure myography: 2
EDTA dihydrate	Research Organics	9572E	Dissecting Solution: 0.02 Bath solution for pressure myography: 0.02 Lumen solution for pressure myography: 0.02
D-Glucose	Sigma	G7021	Dissecting Solution: 5 Bath solution for Electrophysiology*: 10 Internal solution for electrophysiology: 20 Isolation solution for myocytes*: 10 Bath solution for pressure myography: 5 Lumen solution for pressure myography: 5
Bovine serum albumin	Sigma	A3912	Dissecting Solution: 1% Lumen solution for pressure myography: 1%
pH			Dissecting Solution: 7.4 Bath solution for Electrophysiology*: 7.3 Internal solution for electrophysiology: 7.2 Isolation solution for myocytes*: 7.2 Bath solution for pressure myography: 7.4 Lumen solution for pressure myography: 7.4
Osmolarity			Dissecting Solution: 300 Bath solution for Electrophysiology*: 298 Internal solution for electrophysiology: 298 Isolation solution for myocytes*: 298 Bath solution for pressure myography: 300 Lumen solution for pressure myography: 300
			*11
			Table 1. Components of solutions used in the experiment.